發(fā)布時間：2019-07-01 10:13

【摘要】：肝臟是人體最大的器官。既往，肝臟的免疫功能曾被學者們忽視，近年來，越來越多的研究揭示了肝臟在免疫系統中的重要作用。肝臟免疫由固有免疫、適應性免疫及循環(huán)中的其它成份共同組成，其中固有免疫最為關鍵。枯否細胞（KC）是肝臟固有免疫的重要組成部分。KC生物學功能非常廣泛，在肝臟的免疫防御中扮演著重要角色。KC有很強的吞噬能力，可以清除內毒素和其它來自循環(huán)中的外源性物質，也可以去除機體內的細胞碎片、病毒、細菌、凋亡細胞和一些腫瘤細胞等，在受損及感染后引起炎癥反應。KC是專職抗原提呈細胞，可激活輔助T細胞參與觸發(fā)適應性免疫反應。另外，KC也是機體最具分泌活性的細胞，可以分泌多種活性介質參與調節(jié)穩(wěn)態(tài)、宿主抵抗、炎癥等多種免疫反應。值得注意的是，KC還與很多肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展緊密相關。 對乙酰氨基酚（APAP），即撲熱息痛，是目前廣為應用的解熱鎮(zhèn)痛藥之一。在美國及歐洲國家，每年約有45%的急性肝衰竭患者由過量使用APAP引起。在我國，APAP的應用也十分廣泛，除直接應用外，還是很多中、西藥物的重要成份，市面上約有80%已批準抗感冒藥（如：感康、泰諾、白加黑、百服寧和快克等）含有APAP。由于人們醫(yī)療知識缺乏，對藥物認知不足，錯誤、過量服用或交叉服用含APAP成份藥物的情況仍經常發(fā)生，導致患者嚴重肝、腎損傷甚至死亡的情況也不為少見。既往，APAP誘導的肝損傷機制的研究主要關注在毒性發(fā)揮早期階段肝細胞內發(fā)生的生物化學代謝事件。然而，愈來愈多的證據顯示固有免疫在促進和加劇APAP誘導的肝損傷中的重要作用。 KC的重要作用已經在包括APAP在內的多種藥物性肝損傷模型中得以證實。在炎性反應中，破損的肝細胞釋放的細胞信號和死亡肝細胞釋放的損傷相關分子模式均可激活KC。活化后的KC通過釋放多種促炎性細胞因子、趨化因子、ROS和RNS進一步促進肝損傷及炎癥反應的進展。另一方面，KC亦可以釋放具有肝臟保護效果的細胞因子IL-4及抗炎性細胞因子IL-10。因此，KC在APAP誘導的肝毒性損傷中的作用是非常復雜的。近年來的研究中，學者們應用氯化釓和/或脂質體包裹的氯磷酸鹽（CLO）使小鼠/大鼠肝臟內KC耗竭后觀察APAP過量時肝損傷情況以評價KC在APAP誘導的肝毒性損傷中的作用。但是，實驗結論未能統一，KC在APAP誘導的肝損傷中及損傷修復中的作用仍具爭議。本研究的目的在于深入探討KC在APAP誘導的肝毒性損傷的作用及可能原因。 在本實驗中，我們需建立KC缺失的APAP誘導的肝損傷動物模型。首先，經由小鼠尾靜脈注射150ul脂質體包裹的氯膦酸鹽溶液(CLO，5mg/ml)，CLO可被KC內吞并產生KC耗竭效應，對照組小鼠尾靜脈注射等量脂質體溶液(LIP)。在LIP/CLO作用后的24h，即KC耗竭后再經腹腔注射毒性劑量的APAP（500mg/kg）以建立KC缺失的APAP誘導的肝損傷動物模型。血清ALT及肝臟病理切片將用于肝損傷程度的分析。肝非實質細胞及淋巴細胞被分離出來并通過流式細胞術（FACS）進行KC耗竭效果評價及細胞亞型分析。使用免疫組化F4/80抗體對肝臟組織切片中KC進行識別并進行KC耗竭效果評價。應用熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）法檢測小鼠肝臟中細胞因子（TNF-α, IFN-γ, IL-6,IL-1-α, IL-1-β）及趨化因子（CCL2，CXCL1）含量。使用PCNA免疫組化染色及western blot法檢測Cyclin D1蛋白表達以評價肝細胞增殖及損傷修復情況。為除外CLO及KC缺失對APAP藥物代謝的影響，肝臟谷胱甘肽（GSH）濃度將通過Tietze法測得，CYP2E1蛋白質表達將通過western blot法進行測定。 結果顯示，，KC在注射CLO24h后被基本耗竭。CLO對NK、NKT、T細胞及B細胞并沒有產生影響。與預注射LIP的對照組相比，預注射CLO致KC耗竭的實驗組動物在APAP所導致的肝毒性損傷的早期（6h）損傷程度較輕。其證據為，在給予APAP6h后相對較低的血清ALT（對照組為1598±257U/L，預注射CLO組為808±164U/L，p0.05)及明顯減少的小葉中央區(qū)壞死面積(35.5±7.0%和14.5±7.7%, p0.05)。在APAP用藥6h后與預注射LIP的對照組相比，預注射CLO致KC缺失組動物肝內浸潤的炎性單核細胞(CD11b+，Ly6Chi)、招募巨噬細胞(CD11b+, F4/80+)和中性粒細胞(CD11b+，Ly6Ghi)較少，肝臟內趨化因子（CCL2，CXCL1）及細胞因子（TNF-α, IFN-γ, IL-6）mRNA的表達較低。但是，在給予APAP24h后，兩組在血清ALT水平，肝臟病理水平上沒有顯著差異，且預注射CLO組小鼠肝臟內炎性單核細胞、招募巨噬細胞及中性粒細胞總數在APAP注射后24h后，達到了與對照組相近水平。由APAP誘導的肝損傷在APAP給藥后72h基本恢復，APAP給藥后48h及72h兩組血清ALT及肝臟病理水平沒有顯著差異。另外，PCNA免疫組化染色結果及CyclinD1蛋白表達水平在給藥后24h，48h及72h均無差異。兩組間肝臟CYP2E1蛋白以及GSH消耗水平在APAP給藥后組間均無差異。 以上結果顯示KC在APAP誘導肝毒性損傷早期具有促進損傷的作用，其作用機制可能與KC分泌具有促炎性作用的細胞因子及分泌趨化因子致招募炎性單核細胞、巨噬細胞及中性粒細胞增加有關。但是，KC的缺失未對肝損傷后期階段及再生階段的組織修復產生影響，可能是新招募的炎性單核細胞/巨噬細胞代替KC發(fā)揮了抗炎性及創(chuàng)傷修復功能。綜上，我們的研究結果表明KC在APAP誘導的肝損傷早期具有損傷促進作用，為APAP誘導肝毒性損傷早期炎癥控制提供新的思路。另外，提示了肝臟固有免疫與藥物性肝損傷之間的密切聯系，肝臟作為免疫器官值得我們繼續(xù)探索。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575

【參考文獻】

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1 游紹莉;朱冰;榮義輝;臧紅;劉鴻凌;張愛民;辛紹杰;;120例藥物性肝衰竭臨床分析[J];實用預防醫(yī)學;2012年11期

本文編號：2508391