【摘要】：肝纖維化在組織水平上的直接表現(xiàn)是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)過度沉積,肝臟正常結(jié)構(gòu)被破壞。從細胞水平來看,肝臟內(nèi)過度活化的肝星狀細胞大量分泌ECM被普遍認為是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的直接原因。然而,肝細胞的持續(xù)壞死和凋亡可以引發(fā)肝組織內(nèi)早期炎癥反應(yīng),直接激活肝星狀細胞。因此,肝細胞凋亡在肝纖維化發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。盡管大量的實驗證據(jù)表明肝星狀細胞活化和肝細胞凋亡與TGF-β信號通路密切相關(guān),但是對于肝纖維化過程中TGF-β信號參與調(diào)控這些細胞生命活動的具體分子機制,目前的認識依然非常局限。因此,更加全面、深入地闡明肝星狀細胞過度活化和肝細胞持續(xù)凋亡與TGF-β信號通路深層次的調(diào)控關(guān)系仍然是當前亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。充分的研究證據(jù)表明,微小RNA (microRNA, miRNA)和長鏈非編碼RNA (long non-coding RNAs, lncRNAs)作為非編碼RNA (non-coding RNA)家族中最重要的兩種類型參與了諸多人類疾病的發(fā)生發(fā)展過程,它們作為重要的功能分子參與調(diào)控各種信號通路以及一系列細胞生物學(xué)過程也被廣泛地揭示。然而,目前關(guān)于microRNA和lncRNA參與肝纖維化過程中TGF-β信號通路的調(diào)控機制以及它們之間存在的表達調(diào)控關(guān)系尚不清楚。因此,基于以上科學(xué)問題,我們對microRNA和lncRNA與TGF-β信號通路之間的關(guān)系以及它們參與調(diào)節(jié)肝星狀細胞活化和肝細胞凋亡的過程進行了深入地分析和探討。在本文中,我們首先探究了肝纖維化過程中microRNA對活化肝星狀細胞內(nèi)TGF-β信號通路的調(diào)控機制。利用CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型,我們首先觀察到纖維化過程中星狀細胞內(nèi)miR-30的表達顯著下調(diào)。同時,TGF-β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子KLF11的表達顯著上調(diào)。接下來,我們分別在肝星狀細胞和肝纖維化動物模型中研究了miR-30和其潛在的作用靶點KLF11的相互作用及其對肝星狀細胞活化的影響。我們在肝纖維化小鼠模型中利用腺病毒介導(dǎo)肝星狀細胞特異性表達miR-30的方法以研究miR-30的生物學(xué)功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝星狀細胞中過表達miR-30顯著抑制了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化；同時,有效抑制了小鼠肝星狀細胞中KLF11表達并上調(diào)Smad7的水平。進一步對miR-30作用機制的探索表明,KLF11是miR-30的直接作用靶點,并且miR-30可以通過抑制肝星狀細胞內(nèi)KLF11的表達而削弱TGF-β信號通路傳導(dǎo),而KLF11本身又通過抑制負反饋調(diào)節(jié)物Smad7的表達而加強TGF-β信號通路發(fā)生。隨后的調(diào)查發(fā)現(xiàn),利用KLF11過表達載體或siRNA來上調(diào)或下調(diào)肝星狀細胞中KLF11的水平可以促進或抑制肝星狀細胞的活化;同時,利用miR-30的前體或者抑制劑上調(diào)或下調(diào)它在肝星狀細胞內(nèi)的水平證明miR-30可以通過抑制肝星狀細胞的增殖和遷移達到抑制細胞活化的口的。因此,這部分研究揭示了miR-30作為肝纖維化發(fā)生的重要阻遏物通過抑制TGF-β誘導(dǎo)的早期轉(zhuǎn)錄因子KLF11的表達來削弱肝星狀細胞活化過程中TGF-β信號通路的傳導(dǎo),并且為肝纖維化的機制探索提供了重要的研究視野。盡管lncRNAs具有重要的生物學(xué)功能,但它是否以及如何參與肝纖維化的調(diào)控仍然未知。在本部分研究中,我們首先利用高通量測序方法對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝細胞中l(wèi)ncRNAs的表達情況進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維化小鼠肝細胞相對于正常肝細胞,63個lncRNAs發(fā)生了顯著上調(diào),同時48個lncRNAs發(fā)生了顯著下調(diào)。進一步地篩查發(fā)現(xiàn),IincRNA-p21的表達明顯上調(diào)約4倍且關(guān)于它在肝纖維化中的具體作用機制研究尚屬空白。于是,我們分別在肝細胞和肝纖維化小鼠模型中研究了lincRNA-p21參與肝細胞凋亡及其對肝纖維化發(fā)生的影響。我們結(jié)合Northern blot、qRT-PCR以及RT-PCR等方法對肝纖維化過程肝組織和不同類型細胞內(nèi)的lincRNA-p21表達情況進行了分析,發(fā)現(xiàn)在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化過程中,肝細胞內(nèi)的lincRNA-p21表達特異性升高。接下來,我們利用腺病毒介導(dǎo)肝細胞特異性干擾lincRNA-p21的方法以研究lincRNA-p21的生物學(xué)功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)小鼠肝細胞內(nèi)lincRNA-p21水平對肝纖維化具有顯著治療作用,且下調(diào)此過程中l(wèi)incRNA-p21的表達可以有效抑制肝細胞的凋亡并促進肝細胞增殖。我們又對lincRNA-p21影響肝細胞凋亡的作用機制進行了探究,利用生物信息學(xué)分析結(jié)合熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21序列中存在與miR-30家族種子序列保守結(jié)合的位點。與此同時,在體外分別對miR-30和lincRNA-p21進行生物素標記并對肝細胞進行RNA pulldown和RNA沉淀實驗發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21可與miR-30特異性地結(jié)合。最后,通過干擾小鼠肝細胞miR-30的表達抵消了lincRNA-p21干擾腺病毒在肝纖維化模型中的療效。因此,我們的研究從肝細胞入手,揭示了lincRNA-p21在肝纖維化過程中被誘導(dǎo)表達并通過與肝細胞內(nèi)的miR-30競爭性結(jié)合而參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程,并確定了lincRNA-p21可作為一種新型的競爭性內(nèi)源非編碼RNA參與肝細胞凋亡和增殖的調(diào)控,這也為肝纖維化的治療提供了新的靶點和研究思路。
[Abstract]:The direct expression of hepatic fibrosis at the tissue level is the excessive deposition of the extracellular matrix (ECM) and the normal structure of the liver is destroyed. From the cell level, a large number of secretory ECMs of the hyperactivated hepatic stellate cells in the liver are generally considered to be a direct cause of the occurrence of hepatic fibrosis. However, the continuous necrosis and apoptosis of the liver cells can initiate the early inflammatory reaction in the liver tissue and directly activate the hepatic stellate cells. Therefore, hepatocyte apoptosis plays a key role in the pathogenesis of hepatic fibrosis. Although a large number of experimental evidence suggests that the activation of the hepatic stellate cells and the apoptosis of the hepatocytes are closely related to the TGF-signaling pathway, the present recognition is still very limited to the specific molecular mechanism involved in the control of these cellular life activities during the liver fibrosis. Therefore, it is still a key scientific problem to be solved urgently. The sufficient study evidence indicates that microRNA (microRNA, miRNA) and long-chain non-coding RNAs (lncRNAs) are the most important two types of non-coding RNA (non-coding RNAs) in the development of many human diseases, They are also widely disclosed as important functional molecules involved in the regulation of various signal pathways and a range of cell biological processes. However, the regulation and regulation of TGF-signaling pathway in the process of liver fibrosis with microRNA and lncRNA are not clear. Therefore, based on the above scientific problems, we deeply analyze and discuss the relationship between microRNA and lncRNA and TGF-I signal pathway and their participation in the regulation of hepatic stellate cell activation and hepatocyte apoptosis. In this paper, we first study the regulation and control mechanism of microRNA in the activation of TGF-1 signaling pathway in hepatic stellate cells. In the model of liver fibrosis induced by CCl4, we first observed that the expression of miR-30 in the star-like cells was significantly reduced in the course of fibrosis. At the same time, the expression of the transcription regulatory factor KLF11 induced by TGF-1 was up-regulated. Next, we studied the interaction of miR-30 and its potential target KLF11 and its effect on the activation of hepatic stellate cells in the model of hepatic stellate and hepatic fibrosis, respectively. We use adenovirus-mediated hepatic stellate cell specific expression of miR-30 in the liver fibrosis mouse model to study the biological function of miR-30. The results showed that the expression of miR-30 in the hepatic stellate cells significantly inhibited the liver fibrosis induced by CCl4, and the expression of KLF11 in the hepatic stellate cells of the mice was effectively inhibited and the level of Smad7 was increased. Further exploration of the action mechanism of miR-30 shows that KLF11 is a direct target of miR-30, and miR-30 can weaken the conduction of the TGF-1 signal by inhibiting the expression of KLF11 in the hepatic stellate cell, and the KLF11 itself enhances the TGF-1 signal path by suppressing the expression of the negative feedback regulator Smad7. Subsequent investigations have found that the level of the KLF11 in the hepatic stellate cells can be raised or reduced by the use of the KLF11 overexpression vector or siRNA to promote or inhibit the activation of the hepatic stellate cells, Up-regulation or down-regulation of its level in the hepatic stellate cell using a precursor or inhibitor of miR-30 demonstrates that miR-30 can inhibit cell activation by inhibiting the proliferation and migration of hepatic stellate cells. Therefore, this part of the study revealed that the important repressor of miR-30 as a hepatic fibrosis, by inhibiting the expression of the early transcription factor KLF11 induced by TGF-1, weakened the conduction of the TGF-1 signal pathway in the activation of the hepatic stellate cells, And provides an important field of research for the mechanism of liver fibrosis. Although lncRNAs have important biological functions, it is not known whether or not it is involved in the regulation of hepatic fibrosis. In this part of the study, we first used the high-throughput sequencing method to detect the expression of lncRNAs in the liver-fibrosis mouse liver cells induced by CCl4. The results showed that the liver cells of the fibrotic mice were significantly up-regulated with respect to the normal hepatocytes and 63 lncRNAs, and the 48 lncRNAs were down-regulated. Further screening found that the expression of IincRNA-p21 was significantly up-regulated by about 4 times and a study on its specific mechanism of action in hepatic fibrosis was still blank. So, we studied the effect of lincRNA-p21 in the hepatocyte and the liver fibrosis mouse model, and the effect on the hepatic fibrosis. The expression of lincRNA-p21 in the liver and different types of cells in the liver fibrosis was analyzed by using the methods of Northern blot, qRT-PCR and RT-PCR. Next, we studied the biological function of lincRNA-p21 by using adenovirus-mediated hepatocyte-specific interference line cRNA-p21 to study the biological function of lincRNA-p21, and found that the down-regulation of the level of lincRNA-p21 in the mouse hepatocytes has a significant therapeutic effect on the liver fibrosis, And the expression of the lincRNA-p21 in the process can effectively inhibit the apoptosis of the liver cells and promote the proliferation of the liver cells. We also explored the mechanism of the effect of linkcRNA-p21 on the apoptosis of hepatocytes, and by using the bioinformatics analysis combined with the luciferase reporter, it was found that there was a conserved binding site of the seed sequence of the miR-30 family in the linkcRNA-p21 sequence. At the same time, in vitro, the miR-30 and the lincRNA-p21 were labeled with biotin and the hepatocytes were subjected to RNA pulpit and RNA precipitation experiments, and the linkcRNA-p21 can be specifically combined with the miR-30. Finally, by interfering with the expression of miR-30 in the mouse liver cells, the effect of the lincRNA-p21 interference adenovirus in the liver fibrosis model was cancelled. Therefore, our research starts with the liver cells, and reveals that the linkcRNA-p21 is induced to express in the liver fibrosis process and is involved in the development of the liver fibrosis through the competitive binding of the miR-30 in the liver cells, And it is determined that the linkcRNA-p21 can be used as a novel competitive endogenous non-coding RNA to participate in the regulation of the apoptosis and the proliferation of the liver cells, which also provides a new target point and a research thinking for the treatment of the liver fibrosis.
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2

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本文編號：2486753