發(fā)布時間：2019-05-12 20:08

【摘要】：目的:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全球最常見的慢性肝臟疾病之一,可分為單純性脂肪肝(Nonalcoholic simple fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)及肝硬化,其中NASH是NAFLD疾病進程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),但NASH的發(fā)病機制尚不明確。最新研究證實,線粒體功能障礙,可誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化,加重炎癥反應(yīng),而PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是清除受損線粒體的經(jīng)典途徑之一。本研究旨在通過檢測PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬水平,探討線粒體自噬對NASH病情演變過程中NLRP3依賴性炎癥反應(yīng)的影響。方法:采用膽堿蛋氨酸缺乏(Methionine-choline deficient diet,MCD)飲食構(gòu)建小鼠NASH模型,其對照組喂食膽堿蛋氨酸含量充足(Methionine-Choline sufficient diet,MCS)的飼料。檢測小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate transam inase,AST)、總超氧化物歧化酶(Total-superoxide dismutase,T-SOD)、丙二醛(Methane dicarboxylic aldehyde,MDA)、過氧化氫(H2O2)水平;部分肝組織石蠟包埋后切片,用于蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson染色、油紅O染色觀察肝臟病理變化;余肝組織經(jīng)液氮速凍后,-80℃冰箱保存,用于實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)檢測肝組織PINK1、Parkin、NLRP3、caspase 1、ASC、IL1β、IL18 mRNA表達,Western blot檢測肝組織LC3Ⅱ、P62、PINK1、Parkin、NLRP3的表達。結(jié)果:1成功構(gòu)建小鼠NASH模型實驗結(jié)果可見0周組小鼠體毛整齊有光澤,體重正常,活動度正常,精神良好,進食正常;MCS 4周組及MCS 8周組小鼠體毛整齊有光澤,體重增加,活動正常,精神良好,進食正常;MCD 4周組小鼠體毛凌亂、無光澤,體重減輕,活動減弱,精神欠佳,進食減少;mcd8周組小鼠的體毛凌亂、無光澤,體重明顯減輕,活動減弱,精神萎靡,進食量明顯下降。小鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)比較:與0周組及mcs對照組相比,mcd模型組小鼠的體重均明顯降低(p0.01),但mcd8周組體重與mcd4周組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義;mcd8周組小鼠肝指數(shù)較0周組、mcd4周組及mcs8周組升高(p0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2小鼠血清生化指標(biāo)與0周組及mcs對照組相比,mcd模型組小鼠血清alt、ast水平均明顯升高(p0.01),且mcd8周組alt、ast水平較mcd4周組升高(p0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3肝臟大體標(biāo)本的觀察0周組及mcs4周組小鼠肝臟呈深紅色,有光澤,質(zhì)軟,邊緣銳利,密度正常;mcd4周組小鼠肝臟體積增大、呈淡黃色、可見組織間充盈淡黃色脂肪斑點、邊緣變鈍;mcs8周組小鼠肝臟呈淡紅色、有光澤、偶見組織間有淡黃色脂肪斑點、邊緣銳利;mcd8周組小鼠肝臟體積增大、呈黃色、可見黃色脂肪斑,密度降低、邊緣鈍。4肝組織病理學(xué)改變he染色結(jié)果顯示:0周組及mcs4周組:肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,以中央靜脈為中心,肝細胞索呈放射狀排列,肝細胞結(jié)構(gòu)完整,大小均勻,無變性、壞死及炎細胞浸潤;mcd4周組:大量肝細胞內(nèi)存在脂肪空泡,部分區(qū)域出現(xiàn)肝索結(jié)構(gòu)紊亂,可見炎細胞浸潤;mcs8周組:偶見散在的脂質(zhì)沉積和脂肪變,但無大泡樣改變及炎細胞浸潤;mcd8周組:肝細胞內(nèi)充滿大量大小不一的脂肪空泡,肝細胞結(jié)構(gòu)紊亂呈氣球樣變,大量炎細胞浸潤,呈灶狀分布,以單核細胞、淋巴細胞為主。masson染色結(jié)果顯示:0周組及mcs4周組:肝小葉結(jié)構(gòu)完整,除匯管區(qū)內(nèi)有膠原纖維染色外,未見有膠原纖維;mcd4周組:肝小葉結(jié)構(gòu)尚存,纖維局限于匯管區(qū),細胞呈長梭形,竇周隙內(nèi)少量膠原纖維增生;mcs8周組:肝小葉結(jié)構(gòu)完整,匯管區(qū)及竇周隙可見少量膠原纖維增生;mcd8周組:肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,小葉中央有膠原纖維存在,可見明顯的肝細胞壞死及纖維組織增生,增生的膠原纖維分布于竇周隙內(nèi)。油紅o染色結(jié)果顯示:0周組及mcs4周組小鼠肝組織未見紅色脂滴;mcd4周組小鼠肝組織可見大量紅色脂滴,肝小葉內(nèi)含脂滴細胞數(shù)/總細胞數(shù)約為40~65%;mcs8周組可見少量散在紅色脂滴,成小顆粒狀,肝小葉內(nèi)含脂滴細胞數(shù)/總細胞數(shù)約為3~10%;mcd8周組小鼠肝組織可見大量紅色脂滴,部分融合成片,肝小葉內(nèi)含脂滴細胞數(shù)/總細胞數(shù)約為65~90%。肝組織病理nas評分:mcd4周組及mcd8周組肝組織評分較0周組、mcs對照組顯著升高(p0.05),總分5分,符合nash組織學(xué)診斷。5小鼠血清sod、mda、h2o2水平與0周組及mcs對照組相比,mcd模型組小鼠血清mda、h2o2水平均升高,sod水平降低(p0.05);且mcd8周組h2o2水平較mcd4周組升高,而sod水平較mcd4周組降低(p均0.05)。6肝組織pink1、parkin、nlrp3、caspase1、asc、il1β、il18mrna的表達rt-qpcr結(jié)果顯示:與0周組及mcs對照組相比,mcd模型組小鼠肝組織nlrp3、caspase1、asc、il1β、il18mrna表達水平均明顯升高,parkinmrna表達水平降低,且mcd8周組與mcd4周組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);mcd8周組小鼠肝組織pink1mrna表達較0周組、mcd4周組及mcs8周組均明顯升高(p均0.05)。7肝組織lc3Ⅱ、p62、pink1、parkin、nlrp3蛋白的表達westernblot結(jié)果顯示:與0周組及mcs對照組相比,mcd模型組小鼠肝組織pink1、parkin蛋白表達均降低、nlrp3蛋白表達升高,且mcd8周組與mcd4周組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p均0.05);lc3Ⅱ蛋白表達在mcd4周組較0周組、mcs4周組升高,而在mcd8周組降低(p均0.05);p62蛋白表達在mcd8周組較0周組、mcd4周組及mcs8周組均明顯升高(p均0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。8nash小鼠肝組織pink1與nlrp3相關(guān)性分析nash小鼠肝組織pink1與nlrp3呈負相關(guān),相關(guān)系數(shù)為r=-0.821(p0.01)。結(jié)論:1 PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬參與了NASH的病理過程。2線粒體自噬功能障礙,可能通過上調(diào)ROS,激活NLRP3炎癥小體,促進NASH疾病進展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575.5

【參考文獻】

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本文編號：2475669