【摘要】：目的： 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是最常見的傳染性病原菌之全球有超過50%的人群感染。H.pylori感染不但是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因,而且與胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤及胃腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。世界衛(wèi)生組織已將H.pylori列為第一類致癌因子。抗生素為目前治療H.pylori感染的主要藥物,但隨其廣泛應(yīng)用,H.pylori耐藥問題及胃腸道菌群失調(diào)不良反應(yīng)日趨嚴重。因此,研發(fā)新一代安全、高效、高選擇性的抗H.pylori藥物具有重要意義。 在對南藥廣藿香的研究中發(fā)現(xiàn)：(1)主要成分廣藿香醇能顯著抑制小鼠H.pylori感染胃炎的炎癥反應(yīng),減少H.pylori載荷量；(2)高選擇性抑制H. pylori及其特異代謝酶——脲酶,而不影響腸道正常菌群的生長。脲酶不僅是H. pylori區(qū)別于其它胃腸道微生物的主要特征,而且是H.pylori在胃部生存的關(guān)鍵酶,對其致病起決定作用。本研究以脲酶為切入點,應(yīng)用酶學(xué)方法研究廣藿香醇抑制H. pylori脲酶的機理,并通過H.pylori脲酶體外誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞GES-1損傷模型和急性胃潰瘍動物模型的建立,探討廣藿香醇治療H. pylori相關(guān)性胃炎的機理。 方法： 1.廣藿香醇對H.pylori脲酶和洋刀豆脲酶活性抑制作用研究 以H. pylori脲酶和洋刀豆(Jack bean)脲酶為研究載體,通過脲酶活性抑制試驗、抑制類型分析、動力學(xué)研究、抑制位點分析、分子對接研究,探討廣藿香醇特異性抗H. pylori及其脲酶的機理。 2.廣藿香醇對H. pylori脲酶誘導(dǎo)胃上皮細胞GES-1損傷的保護作用 通過H. pylori脲酶體外誘導(dǎo)GES-1細胞損傷模型的建立,模擬H. pylori侵染胃黏膜特征,考察廣藿香醇對脲酶致GES-1損傷的影響；進行相關(guān)炎癥介質(zhì),氧化水平及凋亡分析,從炎癥、氧化應(yīng)激及細胞凋亡角度闡述廣藿香醇治療H. pylori相關(guān)性胃炎的作用機理。 3.廣藿香醇對急性胃黏膜損傷的保護作用研究 分別采用無水乙醇,吲哚美辛,幽門結(jié)扎及水浸應(yīng)激四種誘導(dǎo)方法,建立大鼠急性胃潰瘍模型,考察對潰瘍面積和潰瘍指數(shù)的影響,分析相關(guān)模型炎性介質(zhì),氧化水平,胃黏膜血流量(GMBF)和胃黏液量,評價廣藿香醇對胃黏膜的保護作用及機理。 結(jié)果： 1.廣藿香醇對H.pylori脲酶和洋刀豆脲酶活性抑制作用研究 (1)對脲酶活性抑制作用研究 結(jié)果顯示,廣藿香醇抑制H. pylori和Jack bean脲酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為2.67±0.798mM和2.993±0.411mM,陽性對照乙酰氧肟酸(AHA)抑制H. pylori和Jack bean脲酶的IC50分別為0.585±0.242mM和0.379±0.256mM。抑制作用雖不及AHA,但半數(shù)抑制濃度仍達至毫摩爾級別。 (2)抑制類型分析 H.pylori和Jack bean脲酶酶促反應(yīng)米氏常數(shù)KM分別為1.47±0.12mM和11.12±0.12mM,最大反應(yīng)速度Vmax分別為0.85±0.11mM/min和0.50±0.11mM/min。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法,得到廣藿香醇抑制H. pylori脲酶的動力學(xué)參數(shù)的變化特點：KM不變,vmax降低,屬非競爭性抑制類型;Jack bean脲酶KM減少,vmax降低,屬反競爭性抑制。 (3)動力學(xué)研究 根據(jù)廣藿香醇與脲酶的反應(yīng)進度曲線,反應(yīng)速率常數(shù)vo,vs和kapp分別為1.6×10-1mM/min,1.6×10-2mM/min和1.1min-1,脲酶反應(yīng)過程中呈現(xiàn)濃度依賴性。 (4)抑制位點分析 廣藿香醇對脲酶的作用位點可能是巰基,同時對Ni2+亦有一定影響；對H.pylori和Jack bean脲酶的抑制作用具有不可逆性,加入DTT不可恢復(fù)兩者活性。 (5)分子對接研究 分子對接研究顯示,廣藿香醇作用H.pylori脲酶活性中心,通過羥基螯合活性腔底部Ni2+,并以氫鍵結(jié)合活性中心關(guān)鍵氨基酸殘基,影響脲酶活性構(gòu)象。廣藿香醇對H. pylori脲酶親和力優(yōu)于Jack bean脲酶,與上述抑酶作用及位點分析較為一致。 2.廣藿香醇對H. pylori脲酶誘導(dǎo)胃上皮細胞GES-1損傷的保護作用 MTT和LDH試驗顯示,廣藿香醇(5,10,20μM)對H.pylori脲酶致GES-1細胞存活率下降具有抑制作用；有效降低H. pylori脲酶誘導(dǎo)GES-1致炎因子釋放(IL-2, IL-4, NO和TNF-a),提高抗炎因子水平(IL-13),從而減輕炎癥損傷。／AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,廣藿香醇能有效抑制H. pylori脲酶致GES-1細胞凋亡；與Hoechst染色結(jié)果一致,廣藿香醇干預(yù)后可減少核固縮與碎裂、凋亡小體出現(xiàn)；抑制脲酶致GES-1線粒體膜電位MMP下降,降低ROS產(chǎn)生；顯著提高SOD和CAT活性,降低MDA含量。上述結(jié)果提示,廣藿香醇對H.pylori脲酶所致GES-1損傷的保護作用可能與降低細胞炎癥水平,減輕氧化損傷及抑制凋亡有關(guān)。 3.廣藿香醇對急性胃黏膜損傷的保護作用研究 廣藿香醇(10,20和40mg/kg)口服給藥能有效對抗無水乙醇及吲哚美辛所致大鼠胃黏膜損傷,降低潰瘍面積和潰瘍指數(shù),改善病理形態(tài)及炎癥性反應(yīng)；降低無水乙醇致胃黏膜損傷大鼠血清TNF-a和IL-6含量,提高IL-10水平；提高胃黏膜損傷大鼠胃組織CAT和GSH水平,降低MDA含量；提高胃潰瘍大鼠胃組織中NP-SH和PGE2含量；上調(diào)吲哚美辛致胃潰瘍大鼠胃組織COX-1和COX-2的mRNA表達；提高應(yīng)激性潰瘍大鼠GMBF,改善胃黏膜損傷；提高幽門結(jié)扎大鼠胃黏液含量。由此,廣藿香醇胃黏膜保護作用可能與改善炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)氧化系統(tǒng)平衡,提高PGE2水平和胃黏液含量,改善GMBF,增加胃黏膜防御功能有關(guān)。結(jié)論： 1.廣藿香醇對菌源性和植物源性脲酶的抑制作用較相似,然而其抑制方式存在一定差異；廣藿香醇對H.pylori脲酶親和性高于Jack bean脲酶,可能與其特異性抗H.pylori有關(guān),初步推斷廣藿香醇抑制脲酶的位點為活性中心及其附近氨基酸殘基。 2.建立H.pylori脲酶感染人胃上皮GES-1細胞模型,驗證了廣藿香醇對H.pylori脲酶所致GES-1損傷的保護作用；機制可能與降低細胞炎癥反應(yīng),減輕氧化損傷及抑制凋亡有關(guān)。 3.驗證廣藿香醇對急性胃潰瘍的保護作用,揭示其機制可能與改善炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)氧化系統(tǒng)平衡,提高PGE2水平和胃黏液含量,改善GMBF,增加胃黏膜防御功能有關(guān)。體內(nèi)外胃黏膜保護作用均與炎癥、氧化應(yīng)激相關(guān)。 綜上,廣藿香醇治療H.pylori相關(guān)性胃炎的機制可能包括：(1)抑制脲酶活性,減少H.pylori在體內(nèi)的定植及造成的胃黏膜損傷；(2)改善炎癥反應(yīng),減輕氧化損傷,增加胃黏膜防御功能。研究成果有助闡明廣藿香治療消化系統(tǒng)疾患的藥效物質(zhì)及作用機理,為新型脲酶抑制劑及抗H.pylori相關(guān)性胃炎藥物研發(fā)提供基源于中藥的一類新的先導(dǎo)化合物。
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【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R573.3

【參考文獻】

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本文編號：2464266