【摘要】：研究背景與目的： 炎癥性腸病(inflammatory bowel disease. IBD)包括克羅恩病(Crohn's disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis, UC),是發(fā)生在胃腸道的慢性炎癥性疾病[1]o IBD發(fā)病普遍,在美國約有1400萬患者,在歐洲有2200萬IBD患者[2-3]。近年來,我國的IBD發(fā)病率呈上升趨勢。但其病因和發(fā)病機制尚不清楚,可能是環(huán)境因素、免疫、遺傳、感染等多種因素相互作用,某種抗原的持續(xù)刺激,啟動了腸道免疫炎癥過程,最終導(dǎo)致免疫反應(yīng)過度亢進和難以自限。目前研究認為促炎因子及抑炎因子的平衡是維持機體正常功能的保障,而各種T細胞分泌的多種炎癥因子失調(diào)是引起IBD的主要原因。 細胞因子是指機體的免疫細胞(如T細胞、B細胞、巨噬細胞和單核細胞等)和非免疫細胞(如血管內(nèi)皮細胞、表皮細胞和成纖維細胞等)合成和分泌的一組具有廣泛生物活性的小分子多肽細胞因子,可劃分為促炎細胞因子和抗炎細胞因子。根據(jù)免疫調(diào)節(jié)功能和分泌的細胞因子的不同,目前CD4+T細胞至少可分化為Th1、Th2、Treg、Th17等4個細胞亞群。IBD之前一直被認為是由產(chǎn)生IFN-γ的Thl和產(chǎn)生IL-4/IL-13的Th2介導(dǎo)的,直到最近很多研究報道Kobayashi等[4]發(fā)現(xiàn)IBD患者的腸黏膜組織中Th17細胞以及IL-17、L-21、IL-22等的表達明顯高于正常對照,而在腸黏膜病變區(qū)域中上述指標亦明顯高于非病變區(qū)域,活動期IBD病人血清中IL-17、IL-21、IL-22水平亦升高。與此相似,Seiderer等人在活動性CD患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn),IL-17F mRNA表達水平升高。Th17細胞被認為是介導(dǎo)IBD炎癥反應(yīng)的重要細胞。Th17細胞由IL-6和TGF-β誘導(dǎo)分化,在有IL-23存在的情況下維持和增殖,其分泌的細胞因子包括IL-17(Interleukin-17)A-IL-17F, IL-6, TNF-α, IL-22等。IL-17是Th17細胞分泌的主要細胞因子也是Thl7細胞的主要效應(yīng)因子。目前,IL-17家族有6個配體(IL-17A-F)和5個受體(IL-17RA.RD和SEF)[6]。通常IL-17是指IL-17A是Th17細胞的主要效應(yīng)細胞因子,通過作用于腸道上皮細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、成纖維細胞及結(jié)腸肌纖維母細胞等,誘導(dǎo)釋放促炎性趨化因子、細胞因子及其他促炎介質(zhì)(如前列腺素、粒細胞集落刺激因子等),介導(dǎo)粒細胞的早期動員,參與早期炎性介質(zhì)反應(yīng)。同時介導(dǎo)淋巴細胞及樹突狀細胞的大量募集及聚集,維持腸道持久的炎性介質(zhì)反應(yīng)。另外,IL-17A還參與中性粒細胞的增生、成熟及凋亡,促進樹突狀細胞成熟,通過多種途徑引發(fā)炎性介質(zhì)反應(yīng)[7]。 IBD的傳統(tǒng)治療著眼于控制活動性炎癥、維持緩解和調(diào)節(jié)免疫紊亂,常用的三類藥物包括水楊酸類、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑。它們的治療具有一定的局限性和不可避免的副作用。其對CD與UC的緩解率分別僅為70%與80%左右,最佳的維持緩解方案也僅能使復(fù)發(fā)率降低50%左右,分別約有2/3與1/3的病例最終需手術(shù)治療。而且免疫抑制劑起效時間過長(3-6月),相當比例的患者對此類藥物無效。隨著對IBD發(fā)病機制的深入研究,生物靶向治療成為IBD治療新趨勢[8]。TNF-α是CD關(guān)鍵的促炎反應(yīng)介質(zhì),因而是IBD治療中的重要靶點。目前最常用的TNF-a拮抗劑是英夫利昔單抗(infliximab)。英夫利昔單抗是一種可直接拮抗TNF-α的人鼠嵌合單克隆抗體,已被美國食品與藥物管理局(FDA)批準用于治療難治性CD。數(shù)項多中心雙盲臨床研究證實英夫利昔單抗對活動性CD特別是對有瘺管形成者有效,但也易伴發(fā)嚴重繼發(fā)感染等不良反應(yīng)。 抗代謝藥物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是臨床大腸癌的經(jīng)典一線化療藥物,分子結(jié)構(gòu)是尿嘧啶的5號位氫被氟所取代的衍生物。其結(jié)構(gòu)與尿嘧啶和胸腺嘧啶相似,在血管內(nèi)可被細胞迅速攝取且沿多種途徑迅速代謝轉(zhuǎn)化為其活性代謝產(chǎn)物5氟尿嘧啶脫氧核苷酸(5FdUMP)和5-氟尿嘧啶嘧啶三磷酸脫氧核苷酸(5FdUTP),主要作用在細胞周期的S期。5FdUMP以還原性葉酸為輔酶抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶(ThymidylateSynthase,TS)活性,繼而導(dǎo)致細胞內(nèi)DNA合成前體胸腺嘧啶三磷酸脫氧核苷酸(dTTP)缺乏；5FdUTP則直接摻入RNA；此外,5FdUMP也可進一步磷酸化為5FdUTP,直接摻入DNA,抑制DNA鏈的延長,同時改變DNA的穩(wěn)定性,繼而引起DNA雙鏈斷裂；氟脲嘧啶還可能通過dTTP缺乏影響DNA修復(fù)功能而引起DNA鏈的斷裂。臨床使用大劑量的5-FU化療后主要的毒副作用是全面的骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞有特有的代謝途徑,而正常細胞與腫瘤細胞之間生長分數(shù)的差別,理論上抗代謝藥物仍能殺死腫瘤細胞而不影響正常的細胞。隨著5-FU在臨床上越來越廣泛的應(yīng)用,研究者已逐漸拓寬了該藥的治療范圍,在許多新的領(lǐng)域內(nèi)的疾病應(yīng)用中、低劑量的5-FU都取得了良好的效果。已有很多報道[9-23]5-FU臨床用于局部組織,通過抑制胰蛋白酶的活性有效治療急性胰腺炎、通過抑制纖維母細胞生長以防止眼科手術(shù)術(shù)后機化粘連及治療耳廓假性囊腫、通過抑制5一n還原酶的活性,阻止睪酮轉(zhuǎn)變成雙氫睪酮來治療以腺體增生為主的前列腺增生、通過抑制DNA合成有效治療皮膚白化病、慢性化膿性上頜竇炎、口腔粘膜白斑、外陰白色病變、介入治療輸卵管妊娠、銀屑病、慢性鼻炎、腋臭及復(fù)發(fā)性尖銳濕疣等,在上述報道中5-FU在治療劑量下均未見局部組織壞死的報道。 我們課題組發(fā)現(xiàn)在術(shù)前接受5-FU化療的大腸癌病人中,其腸壁組織的T-bet、 RORyt表達水平較化療前顯著降低,而T-bet、RORyt分別是Th1、Th17重要的轉(zhuǎn)錄因子,提示5-FU可能有抑制Th1、Th17細胞的作用,但是5-FU是細胞毒藥物,大劑量的5-FU作用于活體會出現(xiàn)明顯的骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)等副作用,我們設(shè)想低劑量的5-FU具有選擇性抑制免疫細胞Th1、Th17的作用,從而為IBD治療新途徑提供新的思路和有效依據(jù)。 研究內(nèi)容 1.收集術(shù)前接受5-FU化療的大腸癌病人化療前及化療后腸組織標本,檢測Th1、Th17、Treg細胞相關(guān)指標mRNA的表達,HE染色及免疫熒光染色(immunofluorescence, IF)觀察腸粘膜Th1、Th17細胞相關(guān)標記的表達。 2.制作化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)及免疫細胞轉(zhuǎn)移IBD小鼠模型,分別檢測高低劑量的5-FU對不同的IBD小鼠模型腸炎的療效及相關(guān)副作用的觀察。 3.體外培養(yǎng)野生型小鼠(Wild Type, WT)脾和腸系膜淋巴結(jié)提取的CD4+T細胞,往Th1、Th17及Treg方向極化,觀察低劑量5-FU對Th cell相關(guān)細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的作用。體外分離小鼠腸道固有層淋巴細胞(LPL),往Th0及Th17方向極化,觀察低劑量5-FU對小鼠LPL中Thl7相關(guān)標志的影響。 4.探討低劑量5-FU抑制Th1、Th17相關(guān)細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的機制。 對象與方法 1.術(shù)前接受5-FU化療的大腸癌病人的入組及標本獲�。哼x取2010--2013年期間在南方醫(yī)院住院、術(shù)前接受消化道內(nèi)鏡檢查及接受5-FU化療并手術(shù)治療,確診為大腸癌病人并且資料完整的患者。簽署知情同意書后,登記每例患者的一般情況、臨床表現(xiàn)、檢查及治療記錄等。分別于病人術(shù)前及化療前及化療后在消化道內(nèi)鏡檢查期間或手術(shù)結(jié)束后快速采集患者病灶處標本,無菌PBS緩沖液沖洗后取部分標本立即置入4%中性甲醛溶液中固定,行常規(guī)HE染色及IF染色。其余組織放入標本保存液中隨后保存于-80℃冰箱,提取組織RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法(reverse transcription PCR, RT-PCR)檢測組織內(nèi)Th1、Thl7及Treg相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平。 2.制作化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)IBD小鼠模型：選用SPF級6-8周齡C57BL6小鼠20只,給小鼠飲用3%硫酸葡聚糖(Dextran sodiuM sulfate; DSS)溶液6天,制作化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)急性腸炎模型。小鼠隨機分為"PBS對照組”、“高劑量5-FU組”及“低劑量5-FU組”,分別于DSS給藥周期的第1天開始按10UL/g體重腹腔注射(Intraperitoneal injection,ip)PBS、50mg/kg的5-FU及10mg/kg5-FU。每日觀察小鼠體重、毛發(fā)色澤、活動度及觀察是否排稀便、血便。 3.制作免疫細胞轉(zhuǎn)移IBD小鼠模型：流式分選提取于C57BL6WT小鼠脾和腸系膜淋巴結(jié)的高表達CD45RB分子的CD4+T細胞(CD4+CD45RBhi,初始T細胞),按3-5X105腹腔注射6-8周齡Ragl-/-小鼠.3周后每間隔3天按10UL/g體重腹腔注射PBS、10mg/kg5-FU。每次觀察小鼠體重、毛發(fā)色澤、活動度及觀察是否排稀便、血便。上述兩種腸炎小鼠標本收集及檢測：小鼠常規(guī)麻醉、處死并收集血液、腸系膜淋巴結(jié)、大腸及骨髓標本。按H-E染色法行常規(guī)組織病理學(xué)檢查,觀察組織炎癥情況及專科病理醫(yī)師炎癥程度評分；采用RT-PCR檢測組織內(nèi)Th1、Th17及Treg相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平；采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測各組小鼠血清Th1、Th17細胞因子含量。制備腸系膜淋巴結(jié)單細胞懸液,乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristate acetate, PMA)及INOMESIN刺激后5-5.5小時流式染色CD4、IL-17A及IFN-γ,檢測Th1、Th17相關(guān)細胞因子。分別制作小鼠血涂片和骨髓涂片,Wright染色觀察骨髓抑制情況。 5.體外培養(yǎng)野生型小鼠(Wild Type, WT)脾和腸系膜淋巴結(jié)提取的CD4+T細胞,往Th1、Th17及Treg方向極化,收集T輔助細胞和巨噬細胞上清ELISA檢測相關(guān)細胞因子水平、流式染色上機觀察細胞因子及轉(zhuǎn)錄蛋白表達水平,Western Blot檢測蛋白表達水平,采用RT-PCR檢測組織內(nèi)Th1、Th17及Treg相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平。體外分離小鼠腸道固有層淋巴細胞(LPL),往Th0及Th17方向極化,觀察低劑量5-FU對小鼠LPL中Th17相關(guān)標志的影響。 4.采用人腎胚細胞(293T)細胞,轉(zhuǎn)染RORΓT、STAT3、T-bet及HA-UB等重組質(zhì)粒,加入不同劑量的5-FU,在不同的時間點收集細胞蛋白。采用Western Blot及免疫沉淀(IP)檢測相關(guān)蛋白表達水平。采用熒光素酶報告基因(Luciferace)檢測蛋白與DNA結(jié)合水平。采用Chip assay分別檢測5-FU對Thl細胞T-bet與STAT4結(jié)合和Th17細胞中RORΓT與STAT3結(jié)合的影響。 5.采用凋亡試劑盒對不同劑量5-FU處理的SW620及Th0細胞染色,流式上機。 6.統(tǒng)計學(xué)分析 動物及人體試驗部分采用SPSS17.0軟件(Chicago, Illinois, USA)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以X+_S表示,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布(Normality test)及方差齊同(Levene方差齊性檢驗)的條件下,兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本T檢驗,配對資料采用配對樣本T檢驗,多組間均數(shù)比較采用單項方差分析(One-way ANOVA檢驗),多重比較采用LSD法；若數(shù)據(jù)正態(tài)分布但方差不齊,兩組間采用Satterthwaite近似T檢驗,多組間采用近似F檢驗Welch法。以P0.05計為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)果 1.共入選術(shù)前接受5-FU化療的大腸癌病人8例、術(shù)前未接受化療的大腸癌病人8例、術(shù)前接受其他化療方式的大腸癌病人8例。IF結(jié)果顯示接受5-FU化療的大腸癌病人腸組織病灶周圍RORΓT及T-bet的表達較化療前顯著降低,而術(shù)前未接受化療及接受其他方式化療的大腸癌病人腸組織病灶周圍RORΓT及T-bet的表達水平無顯著變化。術(shù)前接受5-FU化療的大腸癌病人腸組織的RT-PCR提示Thl及Th17相關(guān)的IL-17A、RORyT及IFN-γ、T-betmRNA表達水平5-FU化療后較化療前顯著降低,而其他分組無明顯變化。 2.DSS造模小鼠出現(xiàn)體重減輕、稀便甚至血便等表現(xiàn)或癥狀。“高劑量5-FU組”出現(xiàn)體重減輕較"PBS組”早,體重減輕幅度較大,腸道組織大體及鏡下炎癥程度較重,病理評分顯著高于"PBS組”。P值而“低劑量5-FU組”出現(xiàn)體重減輕較"PBS組”較晚,體重減輕幅度較小,腸道組織大體及鏡下炎癥程度較輕,病理評分顯著低于"PBS組”。外周血涂片及骨髓穿刺細胞學(xué)涂片提示“高劑量5-FU組”骨髓增生程度較"PBS組”明顯減低,而“低劑量5-FU組”與"PBS組”比較無明顯差異。 3. CD4+CD45RBhiT細胞轉(zhuǎn)移種植模型小鼠5-6周后出現(xiàn)體重下降趨勢�！暗蛣┝�5-FU組”出現(xiàn)體重減輕較"PBS組”較晚,體重減輕幅度較小,腸道組織大體及鏡下炎癥程度較輕,病理評分顯著低于"PBS組”。腸系膜淋巴結(jié)單細胞懸液流式染色顯示“低劑量5-FU組”的小鼠產(chǎn)生IL-17A及IFN-Y的CD4+T細胞顯著低于"PBS組”。Q-PCR結(jié)果顯示“低劑量5-FU組”的小鼠IL-17A及IFN-γ mRNA水平顯著低于"PBS組”。 磁珠分選WT小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)的CD4+T細胞,體外培養(yǎng)加相應(yīng)的細胞因子往Th1、Th17及Treg方向極化。流式細胞術(shù)顯示當5-FU劑量降至0.5μM時,Th1、Th17的相應(yīng)細胞因子IFN-γ、IL-17A較對照組仍顯著降低,而Treg相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3無明顯變化。Western Blot結(jié)果顯示Th1、Thl7的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄蛋白T-bet及RORΓT蛋白表達水平較對照組也顯著降低,ELISA顯示Thl、Th17細胞上清中IFN-γ、IL-17A水平較對照組仍顯著降低。Q-PCR顯示IFN-γ 、IL-17AmRNA水平較對照組顯著降低,而Foxp3mRNA水平無明顯差異。提取WT小鼠腸道固有層淋巴細胞LPL,在5-FU (0.5μM)作用下體外往Th0和Th17方向極化培養(yǎng)48h.采用PMA/ionomycin刺激細胞5小時后流式染色上機檢測產(chǎn)生IL-17AT細胞的表達。結(jié)果提示低劑量5-FU (0.5μM)顯著抑制小鼠腸道LPL中Th17細胞的表達。 4.293T細胞轉(zhuǎn)染RORΓT、STAT3、T-bet及HA-UB等重組質(zhì)粒,Western Blot結(jié)果顯示低劑量的5-FU即可降低RORyT、STAT3、T-bet蛋白表達水平。熒光素酶檢測(Luciferace)結(jié)果顯示5-FU抑制RORyT與IL-17啟動子結(jié)合呈劑量依賴性。 5.染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, Chip assay)結(jié)果顯示5-FU劑量為1μM時Thl細胞STAT4與IFN-γ、T-bet啟動子結(jié)合和Th17細胞中STAT3與RORyT及IL-17的啟動子結(jié)合水平較對照組顯著降低。 結(jié)論 大劑量的短期5-FU化療可顯著降低病人腸道組織Thl和Th17相關(guān)細胞因子及轉(zhuǎn)錄蛋白,提示5-FU可能降低病人腸道組織中Thl和Th17的表達。在化學(xué)和免疫IBD動物模型中,低劑量5-FU顯著延緩腸炎的發(fā)生發(fā)展,通過抑制Thl細胞中STAT4與IFN-γ、T-bet啟動子結(jié)合和Th17細胞中STAT3與RORyT及IL-17的啟動子結(jié)合而下調(diào)小鼠體內(nèi)Thl和Th17相關(guān)細胞因子及轉(zhuǎn)錄蛋白的表達,可能是其發(fā)揮抗炎、腸道保護的免疫機制。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R574
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本文編號：2449601