【摘要】：研究背景與目的肝纖維化可由病毒感染、酒精、膽管結(jié)扎和四氯化碳等引起,日本血吸蟲(Schistosoma japonicum,Sj)感染導(dǎo)致的肝纖維化是日本血吸蟲病的主要病理變化。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。TLR4(Toll-like receptor 4)信號通路的活化在肝纖維化中發(fā)揮著重要作用,特別是肝星狀細(xì)胞中TLR4信號通路的活化,但是TLR4通路信號與Sj感染所致肝纖維化的關(guān)系及其機(jī)制不明。我們已經(jīng)報道了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(transglutaminase2,TGM2)在Sj感染所致肝纖維化中起重要作用。因此,本研究的目的是鑒定在肝星狀細(xì)胞內(nèi)的TGM2和TLR4信號通路之間的調(diào)控關(guān)系、以及該調(diào)控在Sj感染所致肝纖維化的作用。研究方法1.日本血吸蟲感染所致肝纖維化動物模型的建立:日本血吸蟲尾蚴通過腹部皮膚貼片法對BALB/c小鼠(健康6-8周齡、SPF級、雌性)進(jìn)行感染,于感染后的第0、5、6、8和12周收集標(biāo)本。2.天狼星紅染色法對日本血吸蟲感染所致肝纖維化動物模型的鑒定:使用Abcam公司的天狼星紅試劑盒及其說明書進(jìn)行。3.對日本血吸蟲感染小鼠使用TLR4信號通路阻斷劑TAK242:在小鼠感染Sj后第4周開始使用,腹腔注射法,2次/周,0.3mg/kg體重/只鼠,連續(xù)注射4周。在感染后第8周收集標(biāo)本。4.對日本血吸蟲感染小鼠使用TGM2抑制劑胱胺:在小鼠感染Sj后第3天開始使用,連續(xù)7天,腹腔注射法,濃度10-2mmol/L,100μL/只小鼠,每天注射1次。在感染后第8周收集標(biāo)本。5.動物標(biāo)本的收集與處理:在相應(yīng)時間點,收集各葉肝臟,分別進(jìn)行總RNA提取、總蛋白和石蠟包埋等處理。6.肝星狀細(xì)胞株的培養(yǎng):肝星狀細(xì)胞株購買于上海細(xì)胞所。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。7.RNA表達(dá)水平的半定量檢測:Trizol法提取組織/細(xì)胞總RNA,繼而用prime Script?RT Master Mix試劑盒按說明書逆轉(zhuǎn)錄成c DNA,利用SYBR Green II PCR Master kit對α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Collagen I、Collagen III、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(TGM2)、CD14、腫瘤壞死因子(TNF)-α、pro-IL-1β以及干擾素誘導(dǎo)蛋白(IP)-10、T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子調(diào)節(jié)活化蛋白(RANTES)等的RNA表達(dá)水平進(jìn)行半定量檢測。8.蛋白表達(dá)水平檢測:使用Western blotting法和免疫組織化學(xué)染色結(jié)合H-score半定量法。9.蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞定位:采用免疫熒光檢測法結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察及后續(xù)的Image J軟件分析法。研究結(jié)果:1.TLR4信號通路活化的關(guān)鍵分子的水平與日本血吸蟲感染后5、6、8周的肝臟組織中膠原表達(dá)水平和α-SMA的表達(dá)水平一致;2.用TAK242抑制TLR4信號通路的活化,Sj感染8周肝臟組織的膠原表達(dá)水平和α SMA水平隨之下降;3.Sj感染的肝臟和體外培養(yǎng)的HSC株中都顯示TLR4和α SMA可共定位,并且該共定位的程度隨著TAK242的使用而降低。4.對Sj感染肝臟和體外培養(yǎng)的HSC細(xì)胞株使用TAK242抑制脂多糖(LPS)刺激的TLR4信號通路活化,TGM2的水平隨之降低。5.對Sj感染肝臟和體外培養(yǎng)的HSC細(xì)胞株使用胱胺抑制TGM2的活性,LPS刺激的TLR4信號通路活化可被抑制。6.對體外培養(yǎng)的HSC細(xì)胞株使用TGM2的激動劑全反式維甲酸或者重組TGM2蛋白的刺激,可上調(diào)TLR4信號通路同時伴有α-SMA和膠原的水平上調(diào),該上調(diào)可隨著CTM的使用而受到抑制。結(jié)論:1.TLR4通路活化通過促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化促進(jìn)日本血吸蟲感染引起的肝纖維化2.TGM2和TLR4信號通路之間的正反饋調(diào)控促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化繼而肝纖維化
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575.2

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本文編號：2413950