【摘要】：背景腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的重要成員之一,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)、發(fā)育及功能維持中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),除神經(jīng)系統(tǒng)外,許多外周組織亦可合成和分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF,比如腸粘膜上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及牙周組織。一些研究表明,周圍神經(jīng)細(xì)胞分泌多種可溶性因子如BDNF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)、膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial-derived neurotrophic factor, GDNF),這些因子在維持血神經(jīng)屏障的完整性或者通透性以及調(diào)控緊密連接因子上發(fā)揮著重要作用；在胎兒發(fā)育過(guò)程中,血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌的BDNF因子,通過(guò)其高親和力受體酪氨酸激酶B (tyrosine kinase B, TrkB),發(fā)揮調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮屏障的功能；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,在炎癥因子刺激下,人微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌較多BDNF因子,BDNF通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮鈣黏著蛋白的表達(dá)來(lái)抑制血管內(nèi)皮屏障功能的失調(diào)。鈣黏著蛋白是細(xì)胞間連接蛋白的重要成員之一,在調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞屏障的通透性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在消化系統(tǒng)中,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的成員NGF與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(neurotrophins-3, NT-3)均參與腸道屏障功能的調(diào)控。已有研究表明BDNF在結(jié)腸粘膜中表達(dá)豐富,然而BDNF是否參與調(diào)控腸上皮屏障功能目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。目的1.運(yùn)用基因敲除小鼠模型探討B(tài)DNF在結(jié)腸上皮屏障的生理作用；2.運(yùn)用基因敲除小鼠模型探討B(tài)DNF對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡以及緊密連接蛋白(tight j unction proteins, TJs)的影響；研究參與BDNF+/-小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)因子；3.應(yīng)用小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)下調(diào)結(jié)腸上皮細(xì)胞ht-29中BDNF的表達(dá)并研究其對(duì)TJs的影響。4.探討B(tài)DNF因子對(duì)ht-29結(jié)腸上皮細(xì)胞TJs的直接影響。方法1.動(dòng)物試驗(yàn)取健康野生型C5781/6小鼠(BDNF+/+)與基因敲除BDNF+/-小鼠結(jié)腸粘膜標(biāo)本,運(yùn)用尤斯灌流技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸粘膜電阻值(transepithelial resistance, TER),評(píng)估結(jié)腸粘膜完整性；用蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色以及透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)觀察結(jié)腸粘膜上皮的結(jié)構(gòu)；利用末端標(biāo)記法(TUNEL)染色、active-caspase-3染色以及免疫印跡法測(cè)定active-caspase-3、bcl-2和bax含量評(píng)估凋亡情況；利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)TJs (occludin與ZO-1)在結(jié)腸粘膜的表達(dá)與分布,利用免疫印跡法測(cè)定TJs (claudin-1與claudin-2)在結(jié)腸粘膜的表達(dá)。2.細(xì)胞試驗(yàn)以人結(jié)腸上皮細(xì)胞系ht-29為研究對(duì)象,設(shè)計(jì)合成針對(duì)BDNF的小干擾RNA,將BDNF-siRNA轉(zhuǎn)染入結(jié)腸上皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,無(wú)活性的siRNA轉(zhuǎn)染作為對(duì)照組,實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和免疫印跡法檢測(cè)各組結(jié)腸上皮細(xì)胞中BDNF和TJs(occludin、 ZO-1、claudin-2和claudin-1)基因與蛋白表達(dá)水平的變化。為了研究BDNF在結(jié)腸上皮細(xì)胞的直接作用,分別用1ng/m、10ng/ml、100ng/ml BDNF刺激細(xì)胞,選取2h、6h、12h、24h獲取細(xì)胞后,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和免疫印跡法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸上皮細(xì)胞TJs (occludin、ZO-1、claudin-2和claudin-1)基因與蛋白表達(dá)的變化。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20.0軟件,計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。兩組之間的比較的比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法；對(duì)于BDNF因子對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞TJs基因與蛋白的影響,采用單因素方差的Dunnett't分析。P值小于0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.動(dòng)物試驗(yàn)與BDNF+/+小鼠相比,BDNF+/小鼠結(jié)腸上皮屏障破壞,結(jié)腸粘膜超微結(jié)構(gòu)異常,表現(xiàn)為微絨毛缺失、線粒體腫脹、細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞凋亡增加以及細(xì)菌入侵；TUNEL陽(yáng)性結(jié)腸上皮細(xì)胞增多以及caspase活性升高證明了BDNF+/-小鼠結(jié)腸粘膜中上皮細(xì)胞凋亡明顯增多,并且過(guò)多的凋亡細(xì)胞與BDNF+/-小鼠結(jié)腸上皮屏障功能改變存在一定的關(guān)聯(lián)。除此之外,BDNF+/小鼠結(jié)腸粘膜抑制凋亡bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào),而促凋亡bax蛋白表達(dá)上調(diào)。另外,BDNF+/-小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1以及claudin-1表達(dá)下調(diào),而claudin-2表達(dá)上調(diào)。2.細(xì)胞試驗(yàn)向結(jié)腸上皮細(xì)胞ht-29轉(zhuǎn)染siRNA后可以顯著降低BDNF基因與蛋白表達(dá),同時(shí)也下調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)。利用不同濃度的BDNF因子刺激ht-29細(xì)胞,可導(dǎo)致緊密連接蛋白(occludin, ZO-1與claudin-1)表達(dá)下調(diào),而緊密連接蛋白claudin-2表達(dá)上調(diào)。結(jié)論1.與BDNF+/+小鼠相比,BDNF+/-小鼠結(jié)腸上皮屏障破壞伴隨著緊密連接蛋白異常以及細(xì)胞凋亡增多。2.通過(guò)上調(diào)或者下調(diào)結(jié)腸上皮細(xì)胞中BDNF因子的含量,其緊密連接蛋白表達(dá)發(fā)生相應(yīng)的改變。3.BDNF通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)來(lái)維持腸道上皮的屏障功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R574.62

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本文編號(hào)：2395682