【摘要】：研究背景肝纖維化是肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)過度沉積而導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)與功能異常改變的病理變化,是各種慢性肝病進(jìn)展為肝硬化、肝癌的共有基礎(chǔ)和必經(jīng)途徑。就本質(zhì)而言,肝纖維化是肝臟對(duì)各種致病因素造成慢性肝損傷的一種代償性修復(fù)反應(yīng)�，F(xiàn)有研究證實(shí),肝纖維化在一定程度上可以逆轉(zhuǎn),即通過及時(shí)終止損傷因素的刺激并進(jìn)行抗纖維化治療,可有效延緩甚至逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程,繼而阻斷“慢性肝病-肝纖維化-肝硬化-肝癌”的演變過程。遺憾的是,到目前為止,臨床仍舊缺乏安全有效、特異性針對(duì)肝纖維化的治療措施。因此,重視肝纖維化的基礎(chǔ)研究與臨床治療,對(duì)于改善慢性肝病患者預(yù)后,以及降低肝硬化、肝功能衰竭、肝癌等相關(guān)致死率具有重要的理論與實(shí)際意義。肝纖維化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。既往研究表明,肝內(nèi)多種細(xì)胞參與肝纖維化的形成過程,其中肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)的激活和表型轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是纖維化進(jìn)程中的中心環(huán)節(jié)與關(guān)鍵事件。當(dāng)肝臟受損時(shí),在肝內(nèi)多種因素刺激下,HSCs由富含維生素的靜息狀態(tài)活化為具有增殖、收縮、促炎及促纖維化能力的肌成纖維細(xì)胞,在肝臟損傷部位移行,合成并分泌大量富含膠原的ECM,招募更多炎性細(xì)胞至受損部位,進(jìn)而造成肝臟結(jié)構(gòu)與功能異常,發(fā)生纖維樣病變。研究表明,上述過程受到多種基因與信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。其中Wnt(Wingless-type MMTV integration site)信號(hào)通路與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。但是,Wnt家族成員復(fù)雜,其作用和機(jī)制不盡相同,在HSCs活化和肝纖維化進(jìn)程中的具體機(jī)制尚未完全闡明。Wnt2b分子是第13個(gè)被克隆出的Wnt基因,在人、小鼠、雞和斑馬魚上都高度保守,對(duì)于器官生成與組織修復(fù)具有重要的生理意義。研究發(fā)現(xiàn)Wnt2b分子對(duì)于胚胎時(shí)期肝臟生成是必需的,Wnt2b分子的缺失將導(dǎo)致肝臟發(fā)育不全,對(duì)肝臟再生等過程亦發(fā)揮重要作用;此外,Shackel等人通過cDNA微陣列分析發(fā)現(xiàn),Wnt2b在人原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary Biliary Cirrhosis,PBC)肝組織中呈現(xiàn)基因水平上調(diào)趨勢(shì)。然而,關(guān)于Wnt2b在纖維化相關(guān)肝臟疾病中發(fā)揮的具體作用及機(jī)制尚無研究報(bào)道。因此,我們擬利用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù),通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞接慦nt2b在HSCs活化及肝纖維化形成過程中的作用及機(jī)制。研究目的1.觀察Wnt2b在臨床纖維化相關(guān)肝病患者及肝纖維化模型小鼠肝組織中的表達(dá)水平變化,鑒定Wnt2b的主要細(xì)胞來源;2.分析肝內(nèi)Wnt2b表達(dá)水平對(duì)肝纖維化疾病進(jìn)程及HSCs活化程度的影響;3.闡明Wnt2b調(diào)控纖維化進(jìn)程及HSCs活化的分子機(jī)制。研究方法1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)臨床纖維化相關(guān)肝病患者及健康對(duì)照肝組織芯片中Wnt2b的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè);2.分別應(yīng)用硫代乙酰胺(TAA)、四氯化碳(CC14)腹腔注射法建立小鼠肝纖維化模型;3.應(yīng)用體外CCl4飽和溶液刺激法建立體外肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損模型;4.應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、Western blotting及PCR法檢測(cè)肝組織中Wnt2b蛋白與基因水平;5.應(yīng)用ELISA法檢測(cè)小鼠肝組織勻漿中Wnt2b表達(dá)水平;6.應(yīng)用冰凍切片免疫熒光雙染法檢測(cè)Wnt2b在小鼠肝組織中的表達(dá)與定位;7.應(yīng)用肝臟原位灌流及密度梯度法分離并比較Wnt2b在小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞及非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)水平;8.應(yīng)用肝臟原位灌流及密度梯度法分離鑒定小鼠HSCs,檢測(cè)Wnt2b在纖維化小鼠HSCs中的表達(dá)水平;9.分離野生型C57BL/6小鼠原代HSCs,檢測(cè)體外培養(yǎng)自活化過程中Wnt2b表達(dá)水平;10.通過尾靜脈高壓注射的方式,將Wnt2b沉默/過表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入肝臟,Western blotting檢測(cè)肝組織中Wnt2b蛋白水平以評(píng)價(jià)所用質(zhì)粒效率;11.將TAA造模小鼠隨機(jī)分為四組,即sh-對(duì)照載體組與Sh-Wnt2b組,Over-對(duì)照載體組與Over-Wnt2b組,評(píng)價(jià)沉默/過表達(dá)肝內(nèi)Wnt2b水平對(duì)纖維化進(jìn)程影響:應(yīng)用HE、天狼猩紅染色法、Western blotting、免疫熒光法、流式細(xì)胞術(shù)、ALT法等檢測(cè)干預(yù)肝內(nèi)Wnt2b水平對(duì)TAA造模小鼠肝臟膠原沉積、HSCs活化、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞損傷程度的影響,以評(píng)價(jià)沉默/過表達(dá)肝內(nèi)Wnt2b水平對(duì)纖維化進(jìn)程的可能調(diào)控作用。12.肝臟原位灌流及Opti-Prep密度梯度離心分離野生型C57BL/6小鼠HSCs,體外培養(yǎng)1天(靜息期)及14天(活化期),提取RNA,應(yīng)用PCR法檢測(cè)HSCs Wnt相關(guān)受體表達(dá)情況,并比較靜息期與活化期受體水平變化;13.采取Wnt2b條件培養(yǎng)基孵育HSCs及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt2b過表達(dá)質(zhì)粒兩種方式,模擬纖維化進(jìn)程中旁分泌/HSCs自分泌來源的Wnt2b,并應(yīng)用PCR及Western blotting法檢測(cè)Wnt2b對(duì)HSCs中α-SMA、Ⅰ型膠原基因及蛋白水平影響;14.應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、PCR及Western blotting法檢測(cè)肝組織中β-Catenin蛋白與基因水平;15.應(yīng)用肝臟原位灌流及密度梯度法分離小鼠HSCs,檢測(cè)纖維化小鼠HSCs中β-Catenin的表達(dá)水平;16.分離野生型C57BL/6小鼠原代HSCs,檢測(cè)體外培養(yǎng)自活化過程中β-Catenin表達(dá)水平;17.采取Wnt2b條件培養(yǎng)基孵育HSCs及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt2b過表達(dá)質(zhì)粒兩種方式,模擬纖維化進(jìn)程中旁分泌/HSCs自分泌來源的Wnt2b,應(yīng)用Western blotting法檢測(cè)Wnt2b對(duì)HSCs中β-Catenin表達(dá)水平影響;18.在Wnt2b作用過程中,引入β-Catenin干擾質(zhì)粒,檢測(cè)沉默β-Catenin是否影響Wnt2b對(duì)LX2細(xì)胞α-SMA及Ⅰ型膠原的抑制效應(yīng);19.應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、PCR及Western blotting法檢測(cè)肝組織中TLR4表達(dá)水平;20.應(yīng)用肝臟原位灌流及密度梯度法分離小鼠HSCs,檢測(cè)纖維化小鼠HSCs中TLR4表達(dá)水平;21.應(yīng)用TLR4抑制劑阻斷TLR4信號(hào)通路,然后以Western blotting、天狼猩紅染色法檢測(cè)并評(píng)價(jià)沉默肝內(nèi)Wnt2b而引起的HSCs活化、膠原沉積等效應(yīng)是否是TLR4信號(hào)通路依賴的;22. Western blotting法檢測(cè)Wnt2b對(duì)LPS促進(jìn)LX2細(xì)胞α-SMA及Ⅰ型膠原表達(dá)效應(yīng)的可能影響,以及對(duì)LPS增敏TGF-β促LX2細(xì)胞活化效應(yīng)的影響;23. PCR及Western blotting法檢測(cè)體外Wnt2b作用的LX2細(xì)胞以及體內(nèi)高壓注射Wnt2b過表達(dá)/沉默質(zhì)粒小鼠肝組織TLR4通路相關(guān)分子表達(dá)情況;24.肝臟原位灌流分離小鼠HSCs,免疫熒光法評(píng)價(jià)沉默/過表達(dá)肝內(nèi)Wnt2b水平對(duì)纖維化小鼠HSCs胞內(nèi)NF-κB表達(dá)及核轉(zhuǎn)位的影響。研究結(jié)果1. Wnt2b在人及小鼠纖維化肝臟中表達(dá)升高與健康對(duì)照組相比,臨床纖維化相關(guān)肝病患者肝組織中Wnt2b表達(dá)水平顯著升高。與臨床樣本檢測(cè)結(jié)果一致,TAA及CC14兩種纖維化模型誘導(dǎo)小鼠肝組織中均呈現(xiàn)Wnt2b表達(dá)水平升高現(xiàn)象。這一現(xiàn)象提示,Wnt2b可能參與調(diào)控肝纖維化疾病進(jìn)程。2.肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是纖維化肝臟中表達(dá)Wnt2b的主要來源免疫熒光雙染法結(jié)果提示,Wnt2b主要定位在小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞上。肝臟原位灌流法分離小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞及非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞,結(jié)果顯示,在纖維化小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中Wnt2b蛋白及基因水平均呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì),而在非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中Wnt2b略有上調(diào);體外實(shí)驗(yàn)亦證明,當(dāng)原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受到化學(xué)毒物刺激時(shí),其Wnt2b基因及蛋白水平均可發(fā)生明顯上調(diào)。肝臟原位灌流法分離小鼠HSCs,結(jié)果顯示,從纖維化肝臟分離的HSCs其Wnt2b表達(dá)水平高于正常對(duì)照組;而體外結(jié)果證明在HSCs自活化過程中亦伴隨著Wnt2b表達(dá)水平升高現(xiàn)象,提示作為非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的重要組成部分,活化型HSCs也可一定程度上調(diào)Wnt2b,但其對(duì)于纖維化肝內(nèi)Wnt2b總體水平貢獻(xiàn)程度低于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。以上結(jié)果表明,肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是纖維化肝臟中表達(dá)Wnt2b的主要來源。3. Wnt2b具有抗纖維化發(fā)展作用通過尾靜脈高壓注射的方式,將Wnt2b沉默/過表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入纖維化造模小鼠肝臟,Western blotting結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,注射Wnt2b沉默質(zhì)粒組小鼠肝組織Wnt2b水平降低,而注射Wnt2b過表達(dá)質(zhì)粒組小鼠肝組織Wnt2b蛋白水平升高,提示所用質(zhì)粒有效性,可以用于干預(yù)TAA造模小鼠肝內(nèi)Wnt2b水平,以評(píng)價(jià)Wnt2b對(duì)纖維化進(jìn)程影響。結(jié)果顯示,降低肝內(nèi)Wnt2b水平將明顯促進(jìn)纖維化肝臟膠原沉積、HSCs活化及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),即加劇纖維化疾病進(jìn)程;而升高肝內(nèi)Wnt2b水平可抑制纖維化肝組織內(nèi)膠原沉積、HSCs活化及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),說明Wnt2b具有抗纖維化發(fā)展的作用。4. Wnt2b抑制體外HSCs活化分離野生型C57BL/6小鼠原代HSCs,RT-PCR結(jié)果顯示HSCs表達(dá)多種Wnt家族相關(guān)受體;比較靜息期及活化期HSCs受體水平發(fā)現(xiàn),活化型HSCs中Fzd4與Fzd7受體基因水平上調(diào),提示W(wǎng)nt2b對(duì)HSCs可能存在直接調(diào)控作用。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),Wnt2b條件培養(yǎng)基及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt2b過表達(dá)質(zhì)粒均可顯著抑制HSCs中α-SMA及Ⅰ型膠原基因與蛋白水平,提示旁分泌和/或自分泌來源的Wnt2b對(duì)HSCs活化存在負(fù)向調(diào)節(jié)作用。5. β-catenin在肝纖維化過程中上調(diào)與對(duì)照組相比,TAA造模組小鼠肝臟中β-Catenin基因及蛋白水平均呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢(shì)。肝臟原位灌流法分離小鼠HSCs,結(jié)果顯示,從纖維化肝臟分離的HSCs其β-Catenin表達(dá)水平高于對(duì)照組,且伴有入核增多現(xiàn)象;體外實(shí)驗(yàn)亦證明,在HSCs自活化過程中伴隨著β-Catenin表達(dá)水平升高及核轉(zhuǎn)位增多現(xiàn)象。6. Wnt2b可直接上調(diào)β-Catenin表達(dá)與對(duì)照組相比,尾靜脈高壓注射Wnt2b過表達(dá)質(zhì)粒組小鼠肝臟中β-Catenin表達(dá)水平明顯上調(diào),提示W(wǎng)nt2b可促進(jìn)β-Catenin表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)中,Wnt2b條件培養(yǎng)基及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt2b過表達(dá)質(zhì)粒均可顯著上調(diào)HSCs中β-Catenin表達(dá),提示旁分泌和/或自分泌來源的Wnt2b對(duì)HSCs中β-Catenin存在直接調(diào)控作用。7. Wnt2b抑制HSCs活化不依賴于β-Catenin經(jīng)典通路應(yīng)用β-catenin干擾質(zhì)粒發(fā)現(xiàn),沉默β-catenin并未削弱Wnt2b對(duì)LX2細(xì)胞α-SMA及Ⅰ型膠原的抑制作用,提示W(wǎng)nt2b雖然可促進(jìn)β-catenin表達(dá)及活化,但這并非是其發(fā)揮抗纖維化效應(yīng)的關(guān)鍵機(jī)制,提示W(wǎng)nt2b可能循其它通路調(diào)控HSCs活化及纖維化進(jìn)程。8. TLR4在肝纖維化過程中上調(diào)與對(duì)照組相比,TAA造模組小鼠肝臟中TLR4基因及蛋白水平呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢(shì)。肝臟原位灌流法分離小鼠HSCs,結(jié)果顯示,從纖維化肝臟分離的HSCs其TLR4表達(dá)水平高于對(duì)照組。同時(shí)可觀察到小腸細(xì)菌過度生長(zhǎng)及菌群移位現(xiàn)象,提示TLR4通路與纖維化疾病進(jìn)程的相關(guān)性。9. Wnt2b抑制TLR4介導(dǎo)的促纖維化及星狀細(xì)胞活化效應(yīng)與野生型小鼠相比,TLR4-/-小鼠纖維化進(jìn)程減緩,肝內(nèi)膠原沉積減少,佐證TLR4通路對(duì)于纖維化發(fā)展的重要作用。應(yīng)用TLR4抑制劑可逆轉(zhuǎn)沉默肝內(nèi)Wnt2b而引起的HSCs活化、膠原沉積等效應(yīng),提示沉默肝內(nèi)Wnt2b所引起的纖維化相關(guān)指標(biāo)的上調(diào)是TLR4信號(hào)通路依賴的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Wnt2b不僅可抑制TLR4激動(dòng)劑LPS對(duì)HSCs α-SMA及Ⅰ型膠原的上調(diào)效應(yīng),而且對(duì)TLR4通路增強(qiáng)TGF-β的促HSCs活化效應(yīng)亦具有抑制作用,提示W(wǎng)nt2b通過抑制TLR4信號(hào)通路,進(jìn)而發(fā)揮限制HSCs活化及抗纖維化效應(yīng)。10. Wnt2b負(fù)調(diào)HSCs胞內(nèi)TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)Real-time PCR及Western blotting結(jié)果顯示,Wnt2b可顯著抑制LX2細(xì)胞TLR4表達(dá),降低NF-κB及MAPKs磷酸化。進(jìn)一步體內(nèi)研究證實(shí),與對(duì)照組相比,高壓注射Wnt2b過表達(dá)質(zhì)粒組小鼠肝臟中TLR4通路相關(guān)分子受到明顯抑制,而注射Wnt2b沉默質(zhì)粒組小鼠肝臟中TLR4通路活化增高。肝臟原位灌流法分離小鼠HSCs,結(jié)果顯示W(wǎng)nt2b可顯著抑制HSCs胞內(nèi)NF-κB表達(dá)及核轉(zhuǎn)位。以上結(jié)果提示,Wnt2b可抑制TLR4表達(dá)及相關(guān)信號(hào)分子活化。結(jié)論及意義1.本研究發(fā)現(xiàn),Wnt2b在人及小鼠纖維化肝臟中表達(dá)升高,肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是纖維化肝臟中表達(dá)Wnt2b的主要來源,活化后HSCs亦可一定程度上調(diào)Wnt2b表達(dá);并且證實(shí)Wnt2b可以旁分泌和/或自分泌的形式抑制HSCs活化,發(fā)揮抗纖維化發(fā)展的作用;2.雖然β-Catenin在肝纖維化過程中表達(dá)和活化增加,且證實(shí)Wnt2b可直接促進(jìn)β-catenin表達(dá),但是沉默β-Catenin并不影響Wnt2b的抗纖維化效應(yīng),證明Wnt2b不是通過經(jīng)典β-Catenin通路發(fā)揮抗HSCs活化及纖維化進(jìn)程作用;3.本研究闡明,Wnt2b對(duì)于HSCs中TLR4通路存在負(fù)向調(diào)控作用,抑制TLR4通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及靶分子表達(dá);Wnt2b可以抑制TLR4通路對(duì)HSCs的直接促活化效應(yīng),同時(shí)抑制TLR4通路增強(qiáng)HSCs對(duì)TGF-β敏感性的作用,從而抑制TLR4通路活化所介導(dǎo)的促纖維化效應(yīng)。綜上所述,本研究證實(shí)Wnt2b蛋白具有抗肝纖維化發(fā)展的效應(yīng)。研究提示,Wnt2b可能作為一種新型內(nèi)源性的TLR4抑制因子,通過負(fù)向調(diào)控纖維化進(jìn)程中HSCs胞內(nèi)TLR4信號(hào)通路以抑制HSCs活化,從而限制疾病進(jìn)展,揭示了機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種新方式,為治療纖維化相關(guān)肝臟疾病提供了新的思路與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575.2
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本文編號(hào)：2357574