【摘要】：炎性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)是一種以腹瀉、腹痛為主要臨床癥狀的慢性非特異性腸道炎性疾病，具有反復(fù)發(fā)作，難以治愈的特點(diǎn)。潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩�。–rohn's disease, CD）是IBD的主要類型。目前多認(rèn)為是在基因易感的基礎(chǔ)上與持續(xù)性腸道感染、環(huán)境及腸道免疫系統(tǒng)異常等多種因素相關(guān)。近年來(lái)IBD的整體發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，成為我國(guó)消化系統(tǒng)的常見病。然而，由于IBD的發(fā)病機(jī)制不明，迄今尚缺乏真正有效的防治手段。因此，深入研究IBD的發(fā)病過(guò)程中腸道免疫及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將為IBD防治提供理論依據(jù)。 長(zhǎng)期以來(lái)，白介素(interleukin, IL)-9一直被認(rèn)為是Th2類細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病等發(fā)病過(guò)程中具有重要的生物學(xué)效應(yīng)。然而近幾年來(lái)隨著輔助性T細(xì)胞重新分類，IL-9作為Th9獨(dú)特性分泌因子被人們重新重視。在小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(experimental autoimmune encephal-omyelitis, EAE)模型中，特異性阻斷IL-9會(huì)減慢疾病進(jìn)展。在皮膚移植時(shí)，IL-9通過(guò)加強(qiáng)移植物中Foxp3+Treg細(xì)胞抑制作用，抑制宿主抗移植免疫應(yīng)答。在B16黑色素瘤模型中，Th9細(xì)胞分泌IL-9誘導(dǎo)腫瘤組織分泌CC型趨化因子-20(chemokine C-C motifligand20, CCL20)，使抗原提呈細(xì)胞活化并提呈抗原，進(jìn)一步激活的細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞遷移并殺死瘤樣變組織中的腫瘤細(xì)胞。IL-9還能介導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，在肺部超敏反應(yīng)中發(fā)揮作用。IL-9協(xié)同IL-3引起肥大細(xì)胞脫顆粒并釋放炎性介質(zhì)，從而增加氣道高反應(yīng)性，在小鼠哮喘模型中，IL-9的特異性轉(zhuǎn)錄因子PU.1缺陷或PU.1和IL-25均缺陷的小鼠氣道炎癥減輕。在腸道內(nèi)感染時(shí)，IL-9能誘導(dǎo)肥大細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)，進(jìn)一步加重腸道炎癥。IL-9廣泛的生物學(xué)活性及雙向調(diào)節(jié)作用使其日益受到人們的關(guān)注。 腫瘤壞死因子樣配體1A(tumor necrosis factor-like ligand1aberrance,TL1A)是腫瘤壞死因子超家族成員15(TNF superfamily member15,TNFSF15)基因的蛋白產(chǎn)物，主要表達(dá)在人類的內(nèi)皮細(xì)胞，包括人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、成人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞和子宮肌層內(nèi)皮細(xì)胞等，其中以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)最高。近來(lái)研究表明，TL1A在炎癥組織中的巨噬細(xì)胞、固有層T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞(dendric cell, DC)中也有表達(dá)。TL1A與其受體-腫瘤壞死因子受體超家族成員死亡受體3(deathreceptor3, DR3)結(jié)合，為T淋巴細(xì)胞的分化提供協(xié)同刺激信號(hào)，促進(jìn)Th1和Th17細(xì)胞的極化及效應(yīng)功能，從而影響機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，在自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。目前對(duì)TL1A的研究表明，TL1A與IBD密切相關(guān)，TNFSF15基因誘導(dǎo)TL1A的表達(dá)促進(jìn)了IBD的發(fā)生與進(jìn)展，TNFSF15基因作為IBD的易感基因已得到證實(shí)。 Targan等進(jìn)一步采用DSS慢性結(jié)腸炎模型和結(jié)腸炎基因Gαi2敲除的T細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型鼠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)TL1A不僅可單獨(dú)或協(xié)同IL-12和IL-23作用于Th1細(xì)胞分泌IFN(interferon, IFN)-α，同時(shí)還可作用于Th17細(xì)胞使其分泌IL-17增加。近來(lái)，Meylan F等對(duì)T細(xì)胞或DC過(guò)表達(dá)TL1A的轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行研究也發(fā)現(xiàn)，TL1A過(guò)表達(dá)可誘發(fā)IL-13介導(dǎo)的自發(fā)性結(jié)腸炎，并使Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)明顯升高。但其是否對(duì)IL-9蛋白及其mRNA水平的影響尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)在于探索TL1A與IL-9的關(guān)系。 目的：探討TL1A對(duì)右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)誘導(dǎo)的慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠IL-9蛋白水平及mRNA水平的影響。 方法：①L-TG小鼠與C57BL/6WT小鼠（體重15～18g，6-8周）分為Control/WT組、DSS/WT組、Control/TG組、DSS/TG組，每組6只。Control組持續(xù)飲用蒸餾水；DSS組間斷飲用3%DSS，時(shí)間段為分別為第1~5天、第8~12天、第15~19天、第22~26天、及第27、28天，其余時(shí)間飲用蒸餾水。第29天處死動(dòng)物。②每天觀察小鼠精神狀態(tài)、體重變化、活動(dòng)情況、毛發(fā)光澤度、進(jìn)食以及大便改變和便血情況等，評(píng)估疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index, DAI)。③觀察結(jié)腸形態(tài)學(xué)改變，記錄結(jié)腸炎癥程度并評(píng)分、并測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度。④應(yīng)用蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變。⑤應(yīng)用Real-time Q-PCR方法及Western blot技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸組織中IL-9的mRNA及蛋白的表達(dá)變化。⑥應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法分析IL-9在結(jié)腸組織中的表達(dá)部位。⑦提取脾臟的單個(gè)核細(xì)胞，并應(yīng)用ELISA檢測(cè)其上清液中IL-9的濃度。 結(jié)果：①與Control組相比，DSS組小鼠體重顯著下降，DSS/TG組體重顯著低于DSS/WT組；與Control組相比，DSS組DAI評(píng)分逐漸升高，DSS/TG組小鼠毛發(fā)、精神狀態(tài)差，DAI評(píng)分顯著高于DSS/WT組。②與Control組相比，DSS組結(jié)腸明顯充血、水腫，變形、僵硬，與腸周圍組織粘連，結(jié)腸長(zhǎng)度顯著縮短，DSS/TG組與DSS/WT組相比，結(jié)腸長(zhǎng)度縮短。 ②結(jié)腸組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，Control組小鼠結(jié)腸黏膜完整，腺體排列整齊，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及潰瘍；DSS組結(jié)腸黏膜上皮出現(xiàn)不同程度的缺損或者脫落壞死，部分形成潰瘍，隱窩消失，大量腺體破壞或者消失，固有層內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，基層水腫增厚，黏膜及黏膜下層水腫，大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。與Control組相比，DSS組結(jié)腸病理組織評(píng)分顯著升高，DSS/TG組小鼠的結(jié)腸形態(tài)學(xué)評(píng)分及顯微鏡下結(jié)腸病理評(píng)分均顯著高于DSS/WT組。 ③結(jié)腸免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，IL-9的表達(dá)部位主要定位于單個(gè)核細(xì)胞的胞漿中，表達(dá)IL-9的細(xì)胞主要是腸黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞及黏膜下層炎性浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞及腸組織淋巴小結(jié)中的淋巴細(xì)胞。 ④R eal-time Q-PCR檢測(cè)結(jié)腸IL-9mRNA結(jié)果顯示，與Control組相比，DSS結(jié)腸組織中IL-9的mRNA的表達(dá)量顯著增高(P0.05)；DSS/TG組顯著高于DSS/WT組(P0.05)。 ⑤應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸IL-9分別在Control/WT組、DSS/WT組、Control/TG組、DSS/TG組中的相對(duì)表達(dá)量，其結(jié)果顯示：DSS組顯著高于Control組(P0.05)，DSS組之間也有顯著性差異，，與DSS/WT組相比，DSS/TG組顯著增高(P0.05)。 ⑥應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)血清中IL-9的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與Control組相比，DSS組IL-9水平顯著升高(P0.05)；與DSS/WT組相比，DSS/TG組血清IL-9水平顯著增加(P0.05)。 ⑦脾臟單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞提取數(shù)顯示，Control組總數(shù)約為49×106個(gè)±8×106個(gè)，DSS組與之相比明顯升高。ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)后上清液中IL-9的水平結(jié)果如下，與Control組相比，DSS組未刺激前IL-9的明顯升高(P0.05)；刺激后與Control相比，DSS組IL-9的水平也明顯升高(P0.01)；DSS/TG組相比于DSS/WT組顯著增高(P0.05)。 結(jié)論：①在慢性試驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎模型中，小鼠IL-9的表達(dá)水平增高；TL1A能上調(diào)IL-9的表達(dá)水平；②IL-9主要表達(dá)在腸黏膜及黏膜下層炎性細(xì)胞胞漿中。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R574.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Sergio Rutella;Franco Locatelli;;Intestinal dendritic cells in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2011年33期

2 Britta Siegmund;Martin Zeitz;;Innate and adaptive immunity in inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2011年27期

本文編號(hào)：2352630