【摘要】：炎性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)是一種以腹瀉、腹痛為主要臨床癥狀的慢性非特異性腸道炎性疾病，具有反復(fù)發(fā)作，難以治愈的特點。潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩�。–rohn's disease, CD）是IBD的主要類型。目前多認(rèn)為是在基因易感的基礎(chǔ)上與持續(xù)性腸道感染、環(huán)境及腸道免疫系統(tǒng)異常等多種因素相關(guān)。近年來IBD的整體發(fā)病率呈上升趨勢，成為我國消化系統(tǒng)的常見病。然而，由于IBD的發(fā)病機制不明，迄今尚缺乏真正有效的防治手段。因此，深入研究IBD的發(fā)病過程中腸道免疫及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將為IBD防治提供理論依據(jù)。 長期以來，白介素(interleukin, IL)-9一直被認(rèn)為是Th2類細胞產(chǎn)生的細胞因子，在自身免疫性疾病、過敏性疾病等發(fā)病過程中具有重要的生物學(xué)效應(yīng)。然而近幾年來隨著輔助性T細胞重新分類，IL-9作為Th9獨特性分泌因子被人們重新重視。在小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(experimental autoimmune encephal-omyelitis, EAE)模型中，特異性阻斷IL-9會減慢疾病進展。在皮膚移植時，IL-9通過加強移植物中Foxp3+Treg細胞抑制作用，抑制宿主抗移植免疫應(yīng)答。在B16黑色素瘤模型中，Th9細胞分泌IL-9誘導(dǎo)腫瘤組織分泌CC型趨化因子-20(chemokine C-C motifligand20, CCL20)，使抗原提呈細胞活化并提呈抗原，進一步激活的細胞毒性CD8+T淋巴細胞遷移并殺死瘤樣變組織中的腫瘤細胞。IL-9還能介導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，在肺部超敏反應(yīng)中發(fā)揮作用。IL-9協(xié)同IL-3引起肥大細胞脫顆粒并釋放炎性介質(zhì)，從而增加氣道高反應(yīng)性，在小鼠哮喘模型中，IL-9的特異性轉(zhuǎn)錄因子PU.1缺陷或PU.1和IL-25均缺陷的小鼠氣道炎癥減輕。在腸道內(nèi)感染時，IL-9能誘導(dǎo)肥大細胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)，進一步加重腸道炎癥。IL-9廣泛的生物學(xué)活性及雙向調(diào)節(jié)作用使其日益受到人們的關(guān)注。 腫瘤壞死因子樣配體1A(tumor necrosis factor-like ligand1aberrance,TL1A)是腫瘤壞死因子超家族成員15(TNF superfamily member15,TNFSF15)基因的蛋白產(chǎn)物，主要表達在人類的內(nèi)皮細胞，包括人臍靜脈內(nèi)皮細胞、成人皮膚微血管內(nèi)皮細胞和子宮肌層內(nèi)皮細胞等，其中以人臍靜脈內(nèi)皮細胞中表達最高。近來研究表明，TL1A在炎癥組織中的巨噬細胞、固有層T淋巴細胞、單核細胞和樹突細胞(dendric cell, DC)中也有表達。TL1A與其受體-腫瘤壞死因子受體超家族成員死亡受體3(deathreceptor3, DR3)結(jié)合，為T淋巴細胞的分化提供協(xié)同刺激信號，促進Th1和Th17細胞的極化及效應(yīng)功能，從而影響機體免疫調(diào)節(jié)，在自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。目前對TL1A的研究表明，TL1A與IBD密切相關(guān)，TNFSF15基因誘導(dǎo)TL1A的表達促進了IBD的發(fā)生與進展，TNFSF15基因作為IBD的易感基因已得到證實。 Targan等進一步采用DSS慢性結(jié)腸炎模型和結(jié)腸炎基因Gαi2敲除的T細胞轉(zhuǎn)移模型鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)TL1A不僅可單獨或協(xié)同IL-12和IL-23作用于Th1細胞分泌IFN(interferon, IFN)-α，同時還可作用于Th17細胞使其分泌IL-17增加。近來，Meylan F等對T細胞或DC過表達TL1A的轉(zhuǎn)基因鼠進行研究也發(fā)現(xiàn)，TL1A過表達可誘發(fā)IL-13介導(dǎo)的自發(fā)性結(jié)腸炎，并使Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)明顯升高。但其是否對IL-9蛋白及其mRNA水平的影響尚未見報道，本實驗在于探索TL1A與IL-9的關(guān)系。 目的：探討TL1A對右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)誘導(dǎo)的慢性實驗性結(jié)腸炎小鼠IL-9蛋白水平及mRNA水平的影響。 方法：①L-TG小鼠與C57BL/6WT小鼠（體重15～18g，6-8周）分為Control/WT組、DSS/WT組、Control/TG組、DSS/TG組，每組6只。Control組持續(xù)飲用蒸餾水；DSS組間斷飲用3%DSS，時間段為分別為第1~5天、第8~12天、第15~19天、第22~26天、及第27、28天，其余時間飲用蒸餾水。第29天處死動物。②每天觀察小鼠精神狀態(tài)、體重變化、活動情況、毛發(fā)光澤度、進食以及大便改變和便血情況等，評估疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)。③觀察結(jié)腸形態(tài)學(xué)改變，記錄結(jié)腸炎癥程度并評分、并測量結(jié)腸長度。④應(yīng)用蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變。⑤應(yīng)用Real-time Q-PCR方法及Western blot技術(shù)檢測結(jié)腸組織中IL-9的mRNA及蛋白的表達變化。⑥應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法分析IL-9在結(jié)腸組織中的表達部位。⑦提取脾臟的單個核細胞，并應(yīng)用ELISA檢測其上清液中IL-9的濃度。 結(jié)果：①與Control組相比，DSS組小鼠體重顯著下降，DSS/TG組體重顯著低于DSS/WT組；與Control組相比，DSS組DAI評分逐漸升高，DSS/TG組小鼠毛發(fā)、精神狀態(tài)差，DAI評分顯著高于DSS/WT組。②與Control組相比，DSS組結(jié)腸明顯充血、水腫，變形、僵硬，與腸周圍組織粘連，結(jié)腸長度顯著縮短，DSS/TG組與DSS/WT組相比，結(jié)腸長度縮短。 ②結(jié)腸組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，Control組小鼠結(jié)腸黏膜完整，腺體排列整齊，無明顯炎癥細胞浸潤及潰瘍；DSS組結(jié)腸黏膜上皮出現(xiàn)不同程度的缺損或者脫落壞死，部分形成潰瘍，隱窩消失，大量腺體破壞或者消失，固有層內(nèi)大量炎性細胞浸潤，基層水腫增厚，黏膜及黏膜下層水腫，大量淋巴細胞及中性粒細胞浸潤。與Control組相比，DSS組結(jié)腸病理組織評分顯著升高，DSS/TG組小鼠的結(jié)腸形態(tài)學(xué)評分及顯微鏡下結(jié)腸病理評分均顯著高于DSS/WT組。 ③結(jié)腸免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，IL-9的表達部位主要定位于單個核細胞的胞漿中，表達IL-9的細胞主要是腸黏膜固有層單個核細胞及黏膜下層炎性浸潤的淋巴細胞及腸組織淋巴小結(jié)中的淋巴細胞。 ④R eal-time Q-PCR檢測結(jié)腸IL-9mRNA結(jié)果顯示，與Control組相比，DSS結(jié)腸組織中IL-9的mRNA的表達量顯著增高(P0.05)；DSS/TG組顯著高于DSS/WT組(P0.05)。 ⑤應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測結(jié)腸IL-9分別在Control/WT組、DSS/WT組、Control/TG組、DSS/TG組中的相對表達量，其結(jié)果顯示：DSS組顯著高于Control組(P0.05)，DSS組之間也有顯著性差異，，與DSS/WT組相比，DSS/TG組顯著增高(P0.05)。 ⑥應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測血清中IL-9的表達水平，結(jié)果顯示，與Control組相比，DSS組IL-9水平顯著升高(P0.05)；與DSS/WT組相比，DSS/TG組血清IL-9水平顯著增加(P0.05)。 ⑦脾臟單個核細胞細胞提取數(shù)顯示，Control組總數(shù)約為49×106個±8×106個，DSS組與之相比明顯升高。ELISA檢測細胞培養(yǎng)后上清液中IL-9的水平結(jié)果如下，與Control組相比，DSS組未刺激前IL-9的明顯升高(P0.05)；刺激后與Control相比，DSS組IL-9的水平也明顯升高(P0.01)；DSS/TG組相比于DSS/WT組顯著增高(P0.05)。 結(jié)論：①在慢性試驗性潰瘍性結(jié)腸炎模型中，小鼠IL-9的表達水平增高；TL1A能上調(diào)IL-9的表達水平；②IL-9主要表達在腸黏膜及黏膜下層炎性細胞胞漿中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R574.62

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Sergio Rutella;Franco Locatelli;;Intestinal dendritic cells in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2011年33期

2 Britta Siegmund;Martin Zeitz;;Innate and adaptive immunity in inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2011年27期

本文編號：2352630