【摘要】：研究背景 炎癥性腸�。↖nflammatory bowel disease, IBD)是一種近年發(fā)病率明顯增高，但病因尚不十分清楚的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其包括潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD）兩種。目前研究發(fā)現腸道黏膜屏障受損與該病的發(fā)生密切相關。隨著對Th17細胞及其分泌的主要效應細胞因子IL-17的研究，IL-17在該病中的作用逐漸受到關注。半乳糖凝集素9(Galectin-9,Gal-9)是半乳糖凝集素家族的一員，存在于各種生物體內，是一種多糖連接蛋白，我們在前期研究發(fā)現Gal-9可能與腸上皮細胞之間的緊密連接有關，，Gal-9很可能參與維持上皮細胞連接的功能。現在有關IL-17腸上皮黏膜屏障的關系如何，以及Gal-9的表達與黏膜屏障完整性的關系的研究較少。 目的 采用Transwell細胞跨膜共同培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)T84細胞單層（T84monolayar）,模擬腸上皮屏障，通過測量IL-17處理前后T84細胞單層的跨上皮電阻（Transepithelial electric resistance，TER）、辣根過氧化物酶（Horseradishperoxidase，HRP）流量的檢測，研究IL-17對T84細胞單層通透性的影響。進而研究T84細胞單層通透性變化后相應處理組T84細胞單層Gal-9表達的變化，進一步探討Gal-9與腸上皮黏膜屏障完整性的關系。 方法 1．本實驗利用T84細胞單層。研究IL-17對T84對細胞單層通透性的影響，我們將IL-17以及HRP加入到細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側中。通過酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immune assay,ELISA)的方法檢測基底側樣本中的HRP，并測量T84細胞的TER變化。以T84細胞單層TER及HRP流量作為評價T84細胞單層的通透性指標。 2.不同濃度的IL-17加入細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中與T84細胞共同孵育。2小時后測量T84細胞單層TER及HRP流量變化，從而評價不同濃度IL-17對腸上皮細胞系T84細胞單層的屏障功能的影響。 3.細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)隨機分為正常對照組、IL-17組，并給予相應處理。共同培養(yǎng)2小時后，測量各組的TER以及HRP流量。然后收集正常對照組、IL-17組T84細胞上清液，對測量各組的TER以及HRP流量進行數據分析后，采用ELISA方法檢測相應組細胞上清液中Gal-9的變化。從而評價T84細胞單層通透性變化后，腸上皮細胞系T84細胞單層的Gal-9表達的變化。 4.細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)隨機分為正常對照組、IL-17組給予相應處理。共同培養(yǎng)2小時后，測量各組的TER以及HRP流量。收集正常對照組、IL-17組各培養(yǎng)系統(tǒng)中T84細胞，對測量各組的TER以及HRP流量進行數據分析后，用免疫細胞化學的方法檢測T84細胞通透性發(fā)生變化相應濃度IL-17組的Gal-9的表達。從而評價T84細胞單層通透性變化后，腸上皮細胞系T84細胞單層的Gal-9表達的變化。 5．將上述所有實驗結果采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件系統(tǒng)進行分析，所有計量數據均采用均數±標準差進行描述，用Shapiro-Wilk檢驗方法進行正態(tài)性分析，用Levene檢驗方法進行方差齊性分析，多組數據間的比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），對多組數據比較有統(tǒng)計學意義的再進行兩兩比較（LSD-t檢驗）。兩組數據的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，相關性分析用Spearman秩相關。檢驗水準α=0.05，P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。 結果 1．不同濃度IL-17加入細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側后，各濃度的IL-17對T84上皮細胞刺激前后，各濃度IL-17T84上皮細胞相對TER（comparative TER）表現為：當IL-17濃度小于50ng/ml時，增加腸腔側IL-17濃度，不引起上皮細胞跨膜電阻的下降。但當IL-17濃度大于50ng/ml時，隨著IL-17濃度增加，跨膜電阻逐漸下降，與正常對照組及小濃度IL-17組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=560.34，P 0.05）。不同濃度IL-17加入跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側，HRP流量變化如下：當IL-17濃度小于50ng/ml時，增加腸腔側IL-17濃度，不引起HRP流量的增加。但當IL-17濃度大于50ng/ml時，隨著IL-17濃度增加，HRP流量逐漸增加，與正常對照組及小濃度IL-17組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=159.22，P 0.05）。 2.光學顯微鏡下觀察免疫細胞化學結果：IL-17干預過的T84細胞（IL-17組）細胞質、細胞核、細胞膜被染成棕褐色，相對于正常生長T84細胞（陰性對照組）細胞質、細胞核、細胞膜被染成棕褐色程度明顯降低。結果提示：細胞單層通透性增加后，細胞表達的Gal-9較細胞單層通透性正常的Gal-9降低。用ELISA方法檢測腸腔側細胞上清液中Gal-9的水平結果顯示：高濃度IL-17組明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P 0.05）,提示IL-17作用于T84細胞單層引起通透性改變后，相應作用組細胞上清液中Gal-9的表達量較未干預組明顯降低。 3．HRP流量與Gal-9的相關性分析結果：Gal-9與HRP流量之間r=-0.942，P 0.01,說明上清液中Gal-9濃度與HRP流量之間呈負相關關系。 結論 1．IL-17能造成T84細胞單層通透性的增加。 2．T84細胞單層通透性增加后Gal-9的表達量減少。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R574

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 李育蓉;韓根成;黎燕;;半乳凝素-9(galectin-9)的免疫調節(jié)作用研究進展[J];軍事醫(yī)學;2011年07期

本文編號：2347954