發(fā)布時(shí)間：2018-11-21 18:48

【摘要】：研究背景 炎癥性腸�。↖nflammatory bowel disease, IBD)是一種近年發(fā)病率明顯增高，但病因尚不十分清楚的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD）兩種。目前研究發(fā)現(xiàn)腸道黏膜屏障受損與該病的發(fā)生密切相關(guān)。隨著對Th17細(xì)胞及其分泌的主要效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17的研究，IL-17在該病中的作用逐漸受到關(guān)注。半乳糖凝集素9(Galectin-9,Gal-9)是半乳糖凝集素家族的一員，存在于各種生物體內(nèi)，是一種多糖連接蛋白，我們在前期研究發(fā)現(xiàn)Gal-9可能與腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接有關(guān)，，Gal-9很可能參與維持上皮細(xì)胞連接的功能�，F(xiàn)在有關(guān)IL-17腸上皮黏膜屏障的關(guān)系如何，以及Gal-9的表達(dá)與黏膜屏障完整性的關(guān)系的研究較少。 目的 采用Transwell細(xì)胞跨膜共同培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)T84細(xì)胞單層（T84monolayar）,模擬腸上皮屏障，通過測量IL-17處理前后T84細(xì)胞單層的跨上皮電阻（Transepithelial electric resistance，TER）、辣根過氧化物酶（Horseradishperoxidase，HRP）流量的檢測，研究IL-17對T84細(xì)胞單層通透性的影響。進(jìn)而研究T84細(xì)胞單層通透性變化后相應(yīng)處理組T84細(xì)胞單層Gal-9表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討Gal-9與腸上皮黏膜屏障完整性的關(guān)系。 方法 1．本實(shí)驗(yàn)利用T84細(xì)胞單層。研究IL-17對T84對細(xì)胞單層通透性的影響，我們將IL-17以及HRP加入到細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側(cè)中。通過酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immune assay,ELISA)的方法檢測基底側(cè)樣本中的HRP，并測量T84細(xì)胞的TER變化。以T84細(xì)胞單層TER及HRP流量作為評價(jià)T84細(xì)胞單層的通透性指標(biāo)。 2.不同濃度的IL-17加入細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中與T84細(xì)胞共同孵育。2小時(shí)后測量T84細(xì)胞單層TER及HRP流量變化，從而評價(jià)不同濃度IL-17對腸上皮細(xì)胞系T84細(xì)胞單層的屏障功能的影響。 3.細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)隨機(jī)分為正常對照組、IL-17組，并給予相應(yīng)處理。共同培養(yǎng)2小時(shí)后，測量各組的TER以及HRP流量。然后收集正常對照組、IL-17組T84細(xì)胞上清液，對測量各組的TER以及HRP流量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后，采用ELISA方法檢測相應(yīng)組細(xì)胞上清液中Gal-9的變化。從而評價(jià)T84細(xì)胞單層通透性變化后，腸上皮細(xì)胞系T84細(xì)胞單層的Gal-9表達(dá)的變化。 4.細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)隨機(jī)分為正常對照組、IL-17組給予相應(yīng)處理。共同培養(yǎng)2小時(shí)后，測量各組的TER以及HRP流量。收集正常對照組、IL-17組各培養(yǎng)系統(tǒng)中T84細(xì)胞，對測量各組的TER以及HRP流量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后，用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測T84細(xì)胞通透性發(fā)生變化相應(yīng)濃度IL-17組的Gal-9的表達(dá)。從而評價(jià)T84細(xì)胞單層通透性變化后，腸上皮細(xì)胞系T84細(xì)胞單層的Gal-9表達(dá)的變化。 5．將上述所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)方法進(jìn)行正態(tài)性分析，用Levene檢驗(yàn)方法進(jìn)行方差齊性分析，多組數(shù)據(jù)間的比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），對多組數(shù)據(jù)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的再進(jìn)行兩兩比較（LSD-t檢驗(yàn)）。兩組數(shù)據(jù)的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman秩相關(guān)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1．不同濃度IL-17加入細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側(cè)后，各濃度的IL-17對T84上皮細(xì)胞刺激前后，各濃度IL-17T84上皮細(xì)胞相對TER（comparative TER）表現(xiàn)為：當(dāng)IL-17濃度小于50ng/ml時(shí)，增加腸腔側(cè)IL-17濃度，不引起上皮細(xì)胞跨膜電阻的下降。但當(dāng)IL-17濃度大于50ng/ml時(shí)，隨著IL-17濃度增加，跨膜電阻逐漸下降，與正常對照組及小濃度IL-17組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=560.34，P 0.05）。不同濃度IL-17加入跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側(cè)，HRP流量變化如下：當(dāng)IL-17濃度小于50ng/ml時(shí)，增加腸腔側(cè)IL-17濃度，不引起HRP流量的增加。但當(dāng)IL-17濃度大于50ng/ml時(shí)，隨著IL-17濃度增加，HRP流量逐漸增加，與正常對照組及小濃度IL-17組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=159.22，P 0.05）。 2.光學(xué)顯微鏡下觀察免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：IL-17干預(yù)過的T84細(xì)胞（IL-17組）細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜被染成棕褐色，相對于正常生長T84細(xì)胞（陰性對照組）細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜被染成棕褐色程度明顯降低。結(jié)果提示：細(xì)胞單層通透性增加后，細(xì)胞表達(dá)的Gal-9較細(xì)胞單層通透性正常的Gal-9降低。用ELISA方法檢測腸腔側(cè)細(xì)胞上清液中Gal-9的水平結(jié)果顯示：高濃度IL-17組明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）,提示IL-17作用于T84細(xì)胞單層引起通透性改變后，相應(yīng)作用組細(xì)胞上清液中Gal-9的表達(dá)量較未干預(yù)組明顯降低。 3．HRP流量與Gal-9的相關(guān)性分析結(jié)果：Gal-9與HRP流量之間r=-0.942，P 0.01,說明上清液中Gal-9濃度與HRP流量之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論 1．IL-17能造成T84細(xì)胞單層通透性的增加。 2．T84細(xì)胞單層通透性增加后Gal-9的表達(dá)量減少。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R574

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李育蓉;韓根成;黎燕;;半乳凝素-9(galectin-9)的免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J];軍事醫(yī)學(xué);2011年07期

本文編號：2347954