【摘要】：酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)是一種長(zhǎng)期因大量飲酒導(dǎo)致的常見的慢性肝臟疾病之一。其疾病譜從早期的脂肪肝、發(fā)展到酒精性肝炎、肝纖維化及肝硬化。ALD發(fā)病分子機(jī)制復(fù)雜,目前尚無(wú)有效防治藥物。急慢性酒精暴露均可激活枯否細(xì)胞(Kupffer cells,KCs),KCs作為肝臟內(nèi)常駐的巨噬細(xì)胞,其活化在ALD發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮著主要的作用。具有分泌多種細(xì)胞因子、吞噬及免疫調(diào)節(jié)等功能。由于巨噬細(xì)胞本身獨(dú)特的可塑性和異質(zhì)性,其可根據(jù)外在環(huán)境而發(fā)生功能和表型的改變。本研究首先建立NIAAA推薦的Lieber-DeCarli液體飲食加一次性大劑量酒精灌胃的方法小鼠ALD模型。病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)所有慢性酒精喂養(yǎng)的C57BL/6雄性小鼠肝內(nèi)免疫細(xì)胞活化,發(fā)生炎癥,損傷和脂肪化。免疫組化IHC染色結(jié)果顯示模型組較對(duì)照組相比肝組織內(nèi)CD68陽(yáng)性細(xì)胞增多;流式細(xì)胞術(shù)分析原位灌流提取的KCs發(fā)現(xiàn)模型組CD45+F4/80+CD11b+細(xì)胞數(shù)目增多近一倍,且經(jīng)典caMφ(classically activated macrophages)型表面標(biāo)記物TNF-α、IL-1β、NOS2和CCL2,以及替代aaMφ(alternatively activated macrophages)型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物Arg-1、IL-10、Mrc2和CD163水平均升高。這些結(jié)果提示慢性酒精喂養(yǎng)加一次性大劑量酒精灌胃可誘導(dǎo)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞增多,且caMφ型aaMφ型均增多。由于端粒酶活化(telomerase activation,TA)在髓系和淋巴系細(xì)胞活化過程中起著至關(guān)重要的作用,因此本研究主要探討在ALD過程中端粒酶中最主要的限速酶成分,端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)對(duì)巨噬細(xì)胞活化的潛在作用。免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)TERT的表達(dá)定位發(fā)現(xiàn)肝組織中TERT與CD68共表達(dá),在酒精飼料喂養(yǎng)的老鼠肝組織和原代KCs中TERT表達(dá)明顯升高,TA定量分析結(jié)果顯示ALD進(jìn)展期中TA升高近六倍。而且傳代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞RAW264.7中乙醇刺激和脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)誘導(dǎo)的caMφ型中TERT的表達(dá)水平顯著升高。這些結(jié)果提示上調(diào)的TERT可能在由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的ALD進(jìn)展早期發(fā)揮著重要的作用。為了觀察TERT在巨噬細(xì)胞極化中的潛在作用,分別通過siRNA和質(zhì)粒體外干預(yù)其表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)沉默TERT,caMφ型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物TNF-α、IL-1β、NOS2和CCL2 mRNA水平隨之降低,同時(shí)與對(duì)照組相比,促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12分泌減少,反之過表達(dá)TERT,相關(guān)caMφ型標(biāo)志物隨之升高,然而這種獲得性功能研究對(duì)aaMφ型巨噬細(xì)胞極化沒有影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路在ALD進(jìn)展期和體外caMφ型巨噬細(xì)胞中被激活,更重要的是,TERT對(duì)caMφ型巨噬細(xì)胞極化的這種調(diào)控作用是通過調(diào)節(jié)NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。此外,NF-κB的化學(xué)抑制劑PDTC可以顯著降低TERT表達(dá)和caMφ型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。綜上所述,本研究結(jié)果提示ALD進(jìn)展期TERT在巨噬細(xì)胞極化中的調(diào)節(jié)作用以及TERT與p65之間的相互作用,這為乙醇介導(dǎo)的肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)和caMφ巨噬細(xì)胞極化調(diào)控機(jī)制提供了新思路。
[Abstract]:Alcoholic liver disease (Alcoholic liver disease,ALD) is one of the common chronic liver diseases caused by heavy drinking for a long time. Its disease spectrum has developed from early fatty liver to alcoholic hepatitis, liver fibrosis and cirrhosis. The molecular mechanism of ALD is complex, and there are no effective drugs to prevent and cure it. Acute and chronic alcohol exposure can activate Kupffer cells (Kupffer cells,KCs), KCs as a resident macrophage in the liver, its activation plays a major role in the pathogenesis of ALD. It has the function of secreting many cytokines, phagocytosis and immune regulation. Due to its unique plasticity and heterogeneity, macrophages can undergo functional and phenotypic changes according to the external environment. In this study, we first established the ALD model of mice with Lieber-DeCarli liquid diet recommended by NIAAA and one-off high dose alcohol. Pathological analysis showed that all chronic alcohol-fed C57BL/6 male mice had intrahepatic immune cells activation, inflammation, injury and fat. The results of immunohistochemical IHC staining showed that the number of CD68 positive cells in the model group was higher than that in the control group. Flow cytometry analysis of KCs extracted by in situ perfusion showed that the number of CD45 F4 / 80 CD11b cells in the model group nearly doubled, and the classical caM 蠁 (classically activated macrophages) surface markers TNF- 偽, IL-1 尾, NOS2 and CCL2, The levels of Arg-1,IL-10,Mrc2 and CD163, the surface markers of aaM 蠁 (alternatively activated macrophages) macrophages, were increased. These results suggest that chronic alcohol feeding plus one dose of high dose alcohol can induce the increase of macrophages in the liver and the increase of caM 蠁 type aaM 蠁 type. Because telomerase activation (telomerase activation,TA) plays an important role in the activation of myeloid and lymphoid cells, this study focused on the most important rate-limiting enzyme component, telomerase reverse transcriptase (Telomerase reverse transcriptase, in the process of ALD. The potential role of TERT in the activation of macrophages. The expression of TERT and CD68 in liver tissue was detected by immunofluorescence double labeling method. The expression of TERT in liver tissue and primary KCs of rats fed with alcohol concentrate was significantly increased. The quantitative analysis of TA showed that TA increased nearly six times during ALD progression. The expression of TERT in caM 蠁 type induced by lipopolysaccharide (Lipopolysaccharides,LPS) and ethanol stimulation in cultured macrophages was significantly increased. These results suggest that up-regulated TERT may play an important role in the early stage of ALD progression mediated by macrophages. In order to observe the potential role of TERT in macrophage polarization, the expression of TERT was interfered with by siRNA and plasmids in vitro. It was found that the levels of TNF- 偽, IL-1 尾, NOS2 and CCL2 mRNA, the markers of TERT,caM 蠁 type macrophages, were decreased, and the secretion of TNF- 偽, IL-1 尾, IL-6 and IL-12 was decreased, whereas TERT, was over-expressed. The associated caM 蠁 markers increased, but the acquired function study had no effect on the polarization of aaM 蠁 macrophages. Further studies showed that the NF- 魏 B signaling pathway was activated during the ALD progression and in vitro caM 蠁 macrophages. More importantly, the regulation of TERT on the caM 蠁 type macrophage polarization was achieved by regulating the NF- 魏 B pathway. In addition, PDTC, a chemical inhibitor of NF- 魏 B, could significantly reduce the expression of TERT and caM 蠁 macrophage markers. To sum up, the present study suggests the regulatory role of ALD in macrophage polarization and the interaction between TERT and p65, which provides a new idea for ethanol mediated hepatocyte inflammation and caM 蠁 macrophage polarization regulation.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575

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本文編號(hào)：2312538