【摘要】：第一部分BMP9在不同病理模型鼠及人肝臟中的表達(dá)差異目的:探討在NAFLD病人、高脂喂養(yǎng)小鼠及db小鼠肝臟中BMP9mRNA和蛋白的表達(dá)情況。方法:普食喂養(yǎng)(ND)和高脂喂養(yǎng)(HFD)23周的C57BL/6J小鼠各10只、正常人和NAFLD病人、同齡db鼠和野生鼠取肝臟提蛋白和RNA,再經(jīng)Q-PCR和Western blot檢測(cè)BMP9 mRNA和蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果:BMP9 mRNA和蛋白表達(dá)量在HFD小鼠、NAFLD病人和db小鼠肝臟中均顯著低于(p0.01)相應(yīng)對(duì)照組。結(jié)論:BMP9基因的表達(dá)可能與機(jī)體脂代謝相關(guān)。第二部分BMP9表達(dá)上調(diào)對(duì)飽和脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞甘油三酯的影響目的:探討B(tài)MP9表達(dá)上調(diào)對(duì)飽和脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞甘油三酯聚集情況的影響方法:在人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞2,利用飽和脂肪酸FFAs(OA:PA=2:1混合)誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性細(xì)胞模型,根據(jù)細(xì)胞內(nèi)脂滴含量的多少及細(xì)胞狀態(tài)確定合適的FFAs的作用濃度。同時(shí),利用BMP9過(guò)表達(dá)腺病毒(Ad-BMP9)過(guò)表達(dá)BMP9的表達(dá),通過(guò)油紅O染色及細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的測(cè)定來(lái)檢測(cè)BMP9基因?qū)FAs誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集是否有影響。結(jié)果:在人HepG2肝癌細(xì)胞中,成功誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型。根據(jù)油紅O染色結(jié)果確定了FFAs的最適作用濃度為0.25m M;根據(jù)細(xì)胞中熒光表達(dá)情況及BMP9 mRNA和蛋白表達(dá)情況確定BMP9成功過(guò)表達(dá);BMP9 mRNA的表達(dá)隨著FFAs濃度的增加呈下降趨勢(shì),與0m M時(shí)比較,0.25m M FFAs時(shí)BMP9的表達(dá)明顯降低(p0.01)。與Ad-GFP組比較,Ad-BMP9組在FFAs誘導(dǎo)的狀態(tài)下脂滴明顯減少(p0.01),TG的含量顯著降低(p0.01)。結(jié)論:BMP9基因表達(dá)上調(diào)可以減少甘油三酯的聚集。第三部分BMP9過(guò)表達(dá)對(duì)甘油三酯代謝調(diào)節(jié)的可能機(jī)制目的:探討B(tài)MP9在脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性中對(duì)甘油三酯代謝調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。方法:在人HepG2肝癌細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)BMP9基因,加入0.25m M FFAs誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性后,通過(guò)Q-PCR和Western blot檢測(cè)脂肪酸從頭合成相關(guān)基因(SREBP1C、FAS、SCD-1、ACC-1)的mRNA和蛋白的表達(dá);分析信號(hào)通路AMPK的變化情況;利用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)研究BMP9在細(xì)胞中表達(dá)的部位;利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)BMP9基因?qū)REBP1C基因啟動(dòng)子的調(diào)控作用,并尋找可能的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果:與Ad-GFP組相比,Ad-BMP9組在FFAs誘導(dǎo)的狀態(tài)下脂肪酸從頭合成相關(guān)基因(SREBP1C、FAS、SCD-1、ACC-1)的mRNA表達(dá)均顯著降低(p0.01);FAS、SCD-1、SREBP1C蛋白表達(dá)顯著降低(p0.01);ACC和AMPK的蛋白的磷酸化水平均顯著增加(p0.01);而AMPK的總蛋白水平明顯降低(p0.01)。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明BMP9在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá),但細(xì)胞漿中表達(dá)較強(qiáng),核內(nèi)略弱;雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明BMP9基因可顯著下調(diào)SREBP1C基因啟動(dòng)子的活性(p0.05);將啟動(dòng)子截?cái)嗪筮M(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),BMP9基因調(diào)控SREBP1C基因啟動(dòng)子的結(jié)合區(qū)域可能位于SREBP1C基因啟動(dòng)子-212至-381之間,結(jié)合位點(diǎn)為結(jié)合元件LXRE1。結(jié)論:BMP9過(guò)表達(dá)可激活A(yù)MPK信號(hào)通路,通過(guò)減少脂肪酸的從頭合成從而減少肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的聚集;且BMP9基因可經(jīng)結(jié)合位點(diǎn)LXRE1抑制SREBP1C基因的啟動(dòng)子活性。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575

【參考文獻(xiàn)】

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1 Stefano Ballestri;Amedeo Lonardo;Stefano Bonapace;Christopher D Byrne;Paola Loria;Giovanni Targher;;Risk of cardiovascular,cardiac and arrhythmic complications in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2014年07期

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本文編號(hào)：2271575