【摘要】：研究背景過度飲酒所引起的健康問題和社會(huì)問題在世界范圍普遍存在,可引起精神異常,胰腺損傷,心肌損傷等。肝臟作為乙醇的主要代謝器官,大量飲酒可對肝臟造成損害,進(jìn)而發(fā)展為酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)。ALD的發(fā)病進(jìn)程包括酒精性脂肪肝,酒精性肝炎,肝纖維化,肝硬化及肝癌。酒精性肝病的致死率居高不下。直至目前為止,ALD的發(fā)病機(jī)制并不十分明朗,并且相關(guān)治療方式和藥物存在一定的局限性。酒精性脂肪肝是酒精性肝病發(fā)病的前期階段,并且存在可逆性,其特點(diǎn)為肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常蓄積和脂質(zhì)代謝異常,其中腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinesis,AMPK)和其下游分子乙酰輔酶 A羧化酶(acetyl-CoAc arboxylase,ACC)及固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c,SERBR-1c)在酒精所致的肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。諸多研究發(fā)現(xiàn)AMPK及其下游分子ACC和(或)SERBR-1c異常表達(dá)可促進(jìn)肝臟中甘油三酯蓄積。酒精性脂肪肝進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致酒精性肝炎,在這一過程中肝細(xì)胞凋亡(apoptosis)作用關(guān)鍵。諸多學(xué)者發(fā)現(xiàn)有絲分裂原激活蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinas,MAPK)信號通路和自噬參與調(diào)節(jié)乙醇所引起的肝細(xì)胞凋亡。MAPK家族包括p38和JNK,是重要的信號傳導(dǎo)分子,可通過改變p38和(或)JNK磷酸化將細(xì)胞外的信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)。許多研究發(fā)現(xiàn)自噬在維持肝細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)非常重要,其能消化降解細(xì)胞內(nèi)病源物質(zhì),損傷細(xì)胞器和失去正常功能的蛋白質(zhì),進(jìn)而幫助肝細(xì)胞在各種應(yīng)激狀態(tài)下保持正常功能。同時(shí)肝細(xì)胞自噬可受AMPK通路調(diào)節(jié),AMPK通路的激活可上調(diào)自噬水平。科羅索酸是源自枇杷葉的提取物,屬于三萜化合物類,具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,影響MAPK通路和AMPK信號的作用,已被用來研究治療糖尿病,高血脂,動(dòng)脈粥樣硬化,非酒精性脂肪肝等多種疾病。然而科羅索酸對于酒精性肝病發(fā)展的影響及機(jī)制研究并不十分明確。故在本次實(shí)驗(yàn)中,我們旨在探究科羅索酸對于酒精性肝病發(fā)展進(jìn)程中肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常和肝細(xì)胞凋亡的影響,并研究其內(nèi)在作用機(jī)制。第一部分:科羅索酸對乙醇刺激下BRL-3A和HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響及機(jī)制研究研究目的通過乙醇培養(yǎng)BRL-3A和HepG2細(xì)胞體外模擬乙醇所致的肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常,研究科羅索酸干預(yù)對這一過程的影響及相應(yīng)作用機(jī)制。研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,使用含有不同濃度乙醇,科羅索酸,compound C的培養(yǎng)基培養(yǎng)BRL-3A和HepG2細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間。2.甘油三酯含量測定收集空白對照組,不同濃度乙醇處理組和各個(gè)藥物干預(yù)組的細(xì)胞,采用酶法(甘油三酯檢測試劑盒)測定對照組和各個(gè)處理組中細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(Triglyceride,TG)的表達(dá)情況,并進(jìn)行記錄分析。3.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time quantitative PCR)檢測提取正常對照組和不同實(shí)驗(yàn)組BRL-3A和HepG2細(xì)胞RNA,使用PCR儀檢測細(xì)胞中β-actin和SREBP-1c基因表達(dá)情況。4.免疫蛋白印跡(Western blot)檢測提取正常對照組,不同濃度乙醇處理組和各個(gè)藥物干預(yù)組細(xì)胞蛋白,使用Western blot 檢測細(xì)胞中磷酸化 AMPK(p-AMPK),AMPK,磷酸化 ACC(p-ACC)和ACC表達(dá)情況,使用Image J軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究結(jié)果1.乙醇刺激對BRL-3A和HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)合成的影響采用酶法檢測各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對照組相比,乙醇刺激組BRL-3A和HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量明顯增加,呈濃度依賴性。2.科羅索酸對乙醇刺激下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)堆積的影響采用酶法檢測各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與100mM乙醇刺激組相比,科羅索酸組BRL-3A和HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三脂(TG)含量明顯降低,呈濃度依賴性。3.科羅索酸對乙醇刺激下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中AMPK/ACC通路的影響采用 Western blot 技術(shù)檢測各組細(xì)胞中 p-AMPK,AMPK,p-AMPK,AMPK蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對照組相比,乙醇刺激組BRL-3A和HepG2細(xì)胞p-AMPK/AMPK比值和p-ACC/ACC比值均下降;與乙醇刺激組相比,科羅索酸組細(xì)胞中p-AMPK/AMPK比值和p-ACC/ACC比值均上調(diào);說明科羅索酸上調(diào)乙醇所抑制的AMPK通路,并抑制乙醇所激活的ACC通路;而科羅索酸這些效能可被compound C(AMPK通路抑制劑)所削弱。4.科羅索酸對乙醇刺激下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中SREBP-1c表達(dá)的影響采用RT-PCR檢測各組細(xì)胞中SREBP-1cmRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常對照組相比,乙醇刺激組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中SREBP-1c mRNA的表達(dá)量上調(diào),呈濃度依賴性;與乙醇刺激組相比,科羅索酸組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中SREBP-1c mRNA的表達(dá)下降,呈濃度依賴性。5.compound C影響科羅索酸對乙醇刺激下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用采用酶法和RT-PCR檢測各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量和SREBP-1c mR表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在同樣存在乙醇刺激的情況下,與科羅索酸組相比,compound C干預(yù)可增加細(xì)胞中甘油三酯含量,上調(diào)SREBP-1c mRNA的表達(dá)。研究結(jié)論1.乙醇刺激可引起B(yǎng)RL-3A和HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯蓄積。2.在BRL-3A和HepG2細(xì)胞中,科羅索酸通過激活A(yù)MPK通路,抑制ACC通路活性和SREBP-1c的表達(dá)來減輕乙醇刺激所引起的甘油三酯蓄積。第二部分:科羅索酸對乙醇刺激下BRL-3A和HepG2細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制研究目的觀察科羅索酸干預(yù)對乙醇刺激下BRL-3A和HepG2細(xì)胞損傷凋亡的影響,并探究其相關(guān)作用機(jī)制。研究方法1.細(xì)胞分組按照實(shí)驗(yàn)需要分為:正常對照組,乙醇處理組,乙醇+科羅索酸處理組,乙醇+科羅索酸+巴佛洛霉素A1處理組,乙醇+科羅索酸+3-MA處理組,乙醇+科羅索酸+compoundC處理組,乙醇+科羅索酸+BAPTA-AM處理組,乙醇+科羅索酸+毒胡蘿卜素(thapsigargin)處理組。2.MTT檢測將細(xì)胞種于96孔板中,根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求加入乙醇或是藥物干預(yù)24小時(shí)后,使用MTT檢測各組細(xì)胞的存活情況。3.細(xì)胞蛋白免疫印跡檢測(western-blot)提取各處理組細(xì)胞蛋白,使用western-blot檢測各組細(xì)胞中β-actin,bax,bcl-2,p38,磷酸化 p38(p-p38),JNK,磷酸化 JNK(p-JNK),beclin-1,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,p-AMPK和AMPK的表達(dá)情況,并使用Image J分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4.ELISA 檢測收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按照試劑盒說明書,檢測TNF-α濃度并進(jìn)行計(jì)算。5.細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)和鈣離子濃度檢測收集各組細(xì)胞后,分別使用ROS熒光探針,鈣離子熒光探針和流式細(xì)胞檢測儀檢測細(xì)胞中ROS、Ca2+濃度,并使用Flow Jo分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。研究結(jié)果1.乙醇培養(yǎng)對BRL-3A和HepG2細(xì)胞存活的影響采用MTT方法檢測乙醇刺激對BRL-3A和HepG2細(xì)胞存活的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對照組相比,乙醇刺激組BRL-3A和HepG2細(xì)胞存活率明顯降低,呈濃度依賴性。2.科羅索酸對乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞存活的影響采用MTT方法檢測不同濃度科羅索酸對乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞存活的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與乙醇刺激組相比,科羅索酸組BRL-3A和HepG2細(xì)胞的存活率明顯升高,呈濃度依賴性。3.科羅索酸對乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞凋亡的影響采用western-blot檢測各處理組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白bax和bcl-2的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對照組相比,乙醇刺激組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中bax/bcl-2比值明顯上調(diào);與乙醇刺激組相比,科羅索酸組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中bax/bcl-2的比值明顯下調(diào),呈濃度依賴性;說明科羅索酸抑制了乙醇所引起的肝細(xì)胞凋亡。4.科羅索酸對乙醇培養(yǎng)下BRL-3A細(xì)胞炎癥的影響采用ELISA檢測各處理組BRL-3A細(xì)胞上清液中TNF-α的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對照組相比,乙醇刺激組細(xì)胞上清液中TNF-α的含量明顯增高;與乙醇刺激組相比,科羅索酸組細(xì)胞上清液中TNF-α表達(dá)明顯降低;說明科羅索酸抑制了乙醇所致的肝細(xì)胞炎癥。5.科羅索酸對乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中活性氧(ROS)生成的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各處理組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中活性氧生成情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對照組相比,乙醇刺激組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中活性氧含量明顯增高;與乙醇刺激組相比,科羅索酸組細(xì)胞中活性氧含量明顯降低,呈濃度依賴性。6.科羅索酸對乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中MAPK通路的影響采用western blot檢測各處理組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中磷酸化p-38(p-p38),p-38,磷酸化JNK(p-JNK)和JNK的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對照組相比,乙醇刺激組細(xì)胞中p-p38/p38比值和p-JNK/JNK比值均上調(diào);與乙醇刺激組相比,科羅索酸組細(xì)胞p-p38/p38比值和p-JNK/JNK比值明顯下調(diào),呈濃度依賴性;說明科羅索酸抑制了乙醇所激活的p38 MAPK和JNK MAPK通路。7.科羅索酸對乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中自噬狀態(tài)的影響采用western-blot技術(shù)檢測各處理組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中自噬相關(guān)分子beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對照組相比,乙醇刺激組細(xì)胞中beclin-1表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯降低;與乙醇刺激組相比,科羅索酸組細(xì)胞beclin-1表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯上調(diào),呈濃度依賴性;說明科羅索酸上調(diào)了乙醇所抑制的自噬水平。8.3-MA,科羅索酸對乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞存活情況的影響采用MTT檢測各處理組細(xì)胞存活情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在同樣的1OOmM乙醇刺激下,3-MA干預(yù)明顯降低了科羅索酸所升高的細(xì)胞存活率,說明科羅索酸在BRL-3A和HepG2細(xì)胞中是通過激活自噬減輕乙醇刺激下的細(xì)胞凋亡。9.科羅索酸影響乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中自噬狀態(tài)的相關(guān)機(jī)制采用western-bolt技術(shù)檢測各處理組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中p-AMPK、AMPK和beclin-1表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對照組相比,乙醇刺激組細(xì)胞內(nèi)p-AMPK/AMPK比值下調(diào),beclin-1表達(dá)降低;與乙醇刺激組相比,科羅索酸組細(xì)胞p-AMPK/AMPK比值增高,beclin-1表達(dá)增高;而科羅索酸這一調(diào)節(jié)作用可被compound C(AMPK通路抑制劑)所逆轉(zhuǎn)。10.鈣離子在科羅索酸影響乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中自噬狀態(tài)中的作用采用細(xì)胞流式術(shù)檢測各處理組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中胞漿鈣離子濃度情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對照組相比,乙醇刺激組胞漿鈣離子濃度明顯增高;與乙醇刺激組相比,科羅索酸組胞漿鈣離子濃度明顯降低。采用western-bolt技術(shù)檢測各處理組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中beclin-1表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與科羅索酸組相比,BAPTA-AM組和thapsigargin組細(xì)胞內(nèi)beclin-1表達(dá)無明顯改變。Thapsigargin組的胞漿內(nèi)鈣離子濃度和ROS含量均高于科羅索酸組。研究結(jié)論1.科羅索酸可抑制乙醇刺激所引起的BRL-3A和HepG2細(xì)胞凋亡,并且是通過下調(diào)乙醇所激活的ROS/MAPK通路和上調(diào)乙醇抑制的自噬水平而實(shí)現(xiàn)。2.在BRL-3A和HepG2細(xì)胞中,科羅索酸通過激活乙醇所抑制的AMPK通路而上調(diào)自噬水平。第三部分:科羅索酸對酒精灌胃大鼠肝臟損傷的影響及作用機(jī)制研究目的觀察科羅索酸干預(yù)對乙醇灌胃處理Sprague Dawley(SD)大鼠肝臟損傷的影響,并探究其相關(guān)作用機(jī)制。研究方法1.SD大鼠分組情況將健康30只雄性SD大鼠隨機(jī)均分為分為正常對照組,乙醇處理組和科羅索酸治療組。正常對照組每日2次生理鹽水灌胃,使用量與乙醇處理組的酒精量相同。乙醇處理組大鼠使用60%紅星二鍋頭灌胃,在實(shí)驗(yàn)第1,4,8,12周稱重,按照1-4周4.5克(乙醇)/千克(體重)/天,5-8周6.5克(乙醇)/千克(體重)/天,9-12周9克(乙醇)/千克(體重)/天,每天兩次進(jìn)行灌胃,間隔12小時(shí)�？屏_索酸干預(yù)組,在進(jìn)行相同酒精灌胃處理同時(shí),在實(shí)驗(yàn)5-12周加入科羅索酸每天4ml 20%灌胃。2.SD大鼠肝臟組織病理染色采用伊紅蘇木素(HE)染色檢測各組SD大鼠肝臟病理損傷情況;采用油紅染色檢測各組大鼠肝臟脂質(zhì)堆積情況。3.western blot檢測SD大鼠肝臟中各目的蛋白的表達(dá)提取各組大鼠肝臟組織蛋白,采用western blot檢測β-actin,bax,bcl-2,p38,p-p38,JNK,p-JNK,beclin-1,LC3Ⅱ/LCⅠ,p-AMPK 和 AMPK 的表達(dá)情況,并借助Image J軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究結(jié)果1.科羅索酸干預(yù)對乙醇刺激下SD大鼠肝臟病理情況的影響使用HE染色和油紅染色顯示各組大鼠肝臟病理損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對照組SD大鼠相比,乙醇處理組大鼠肝臟呈現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng),肝細(xì)胞腫脹和脂質(zhì)堆積;與乙醇處理組相比,科羅索酸組SD大鼠肝臟中炎癥反應(yīng),肝細(xì)胞腫脹和脂質(zhì)堆積明顯減輕。2.科羅索酸對乙醇刺激下SD大鼠肝臟細(xì)胞凋亡情況的影響使用western-blot技術(shù)檢測各組SD大鼠肝臟中bax和bcl-2蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對照組相比,乙醇處理組大鼠肝臟中bax/bcl-2比值明顯增高;與乙醇處理組相比,科羅索酸組大鼠肝臟中bax/bcl-2比值明顯下降;說明科羅索酸可減輕乙醇刺激所引起的大鼠肝組織細(xì)胞凋亡。3.科羅索酸對乙醇刺激下SD大鼠肝臟中MAPK通路的影響使用westen-blot技術(shù)檢測各組大鼠肝臟中p-38,p-p38,JNK和p-JNK蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示:與正常對照組相比,乙醇處理組大鼠肝臟中p-p38/p38比值和p-JNK/JNK比值均明顯增高;與乙醇處理組相比,科羅索酸組大鼠肝臟中p-p38/p38比值和p-JNK/JNK比值均明顯下調(diào);說明科羅索酸抑制了乙醇刺激所引起的大鼠肝組織中p38 MAPK和JNK MAPK通路的激活。4.科羅索酸對乙醇刺激下SD大鼠肝臟中自噬狀態(tài)的影響及相關(guān)機(jī)制使用western-blot技術(shù)檢測各組SD大鼠肝臟中AMPK,p-AMPK,beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對照組相比,乙醇處理組大鼠肝臟中p-AMPK/AMPK比值,beclin-1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯降低;與乙醇處理組相比,科羅索酸組大鼠肝臟中p-AMPK/AMPK比值,beclin-1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯增高;說明科羅索酸上調(diào)了乙醇刺激所抑制的大鼠肝組織中AMPK/自噬通路。研究結(jié)論1.科羅索酸可改善乙醇灌胃大鼠肝臟的病理損傷和脂質(zhì)堆積。2.科羅索酸可減輕乙醇灌胃大鼠肝臟組織凋亡水平,且是通過抑制乙醇激活的MAPK通路和上調(diào)乙醇所抑制的AMPK/自噬水平而實(shí)現(xiàn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575
，

本文編號：2243209