【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是近年發(fā)病率逐漸增加的慢性肝臟疾病,屬于代謝異常相關性肝病,包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH),可進展為肝硬化或并發(fā)肝細胞癌,嚴重危害人類健康,因此,NAFLD早期診斷及有效治療是防止進展為終末期肝病的重要措施。肝穿刺活檢是目前診斷NAFLD的可靠方法,但由于為創(chuàng)傷性檢查,臨床應用有一定局限性。NASH相關肝纖維化是NAFLD疾病譜中重要的病理階段,探明其發(fā)病機制,尋求特異有效的分子診斷標志及治療靶點至關重要。Micro RNAs(mi RNAs)是長約19-25個核苷酸的非編碼小RNA,由70-100nt雙鏈莖環(huán)前體經(jīng)RNA酶Dicer合成,能夠識別靶m RNA的3’端非編碼區(qū)(3’-untranslated region,3′-UTR),導致翻譯阻遏或m RNA降解。近年來研究表明mi RNAs在NAFLD發(fā)病過程中存在差異表達,而有關mi RNAs對NASH相關肝纖維化的影響研究甚少。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)是肝臟發(fā)生氧化應激損傷時,阻止炎癥反應,發(fā)揮保護氧化組織損傷的關鍵基因,而HO-1在NASH相關肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中對mi RNA的作用至今未見報道。本研究通過建立NASH相關肝纖維化動物模型,應用基因芯、生物信息學、雙熒光素酶報告基因、原代細胞分離培養(yǎng)及si RNA轉染等技術方法,闡明mi RNAs對NASH相關肝纖維化的作用及機制。并進一步探討HO-1的靶向調(diào)控對關鍵mi RNA的影響,觀察HO-1是否能夠通過調(diào)節(jié)相關mi RNA發(fā)揮對脂肪性肝纖維化的調(diào)控作用,為該病的病因探索及疾病防治提供新思路。第一部分NASH相關肝纖維化小鼠肝組織差異表達mi RNAs的篩選與驗證目的:篩選及驗證NASH相關肝纖維化小鼠肝組織差異表達的mi RNAs。方法:選用8周齡雄性C57BL/6J小鼠,采用膽堿-蛋氨酸缺乏(methionine-choline deficient,MCD)飲食建立NASH相關肝纖維化小鼠模型,觀察小鼠肝臟生化學及肝組織病理學變化,采用Western blot技術檢測小鼠肝組織纖維化相關因子的表達變化,利用LC Sciences micro RNA Microarray-20.0 Mouse mi RNA基因表達譜芯片篩選NASH相關肝纖維化差異表達mi RNAs,并采用實時定量PCR進行驗證。結果:MCD飲食建立NASH相關肝纖維化小鼠模型1肝臟生化學變化:NASH相關肝纖維化小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)及天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)顯著高于對照組,P0.05。2肝臟組織病理學特征:NASH相關肝纖維化小鼠肝組織切片呈現(xiàn)肝細胞大泡性脂肪變性,伴點灶狀壞死及炎細胞浸潤,可見竇周纖維化及匯管區(qū)擴大。3肝組織纖維化相關因子的表達變化:Western blot結果顯示,MCD組小鼠肝組織纖維化相關基因的表達變化與肝損傷程度相一致,伴隨肝損傷程度的不斷加重,纖維化相關基因轉化生長因子(transforming growth factorβ1,TGF-β1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Smad4、4型膠原(Collagen Type 4,Col-4)、基質(zhì)金屬蛋白酶2/9(matrixmetallo-proteinase-2/9,MMP-2/9)的表達顯著增加,而基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP-1)、Smad7得表達顯著降低。4 mi RNAs芯片結果:采用mi RNAs芯片篩選NASH相關肝纖維化肝組織中差異表達mi RNAs,篩選出37個差異表達mi RNAs,其中表達上調(diào)19個(mi R-15b-5p、mi R-150-5p、mi R-106a-5p等),下調(diào)18個(mi R-146a-5p、mi R-203-3p、mi R-130a-3p等)。5差異表達mi RNAs的驗證:應用RT-PCR方法檢測,結果顯示NASH相關肝纖維化小鼠肝組織中mi R-15b-5p表達較對照組明顯上調(diào),而mi R-146a-5p及mi R-203-3p表達明顯下調(diào),尤以mi R-146a-5p下調(diào)顯著,與芯片結果一致(P0.05)。結論:1 NASH相關肝纖維化小鼠肝組織中mi RNAs差異表達明顯,提示mi RNAs可能參與了該病的發(fā)病過程。2 mi R-146a-5p在MCD組小鼠的肝組織中表達較正常對照組小鼠明顯降低,提示mi R-146a-5p可能參與了NASH相關肝纖維化的調(diào)控。第二部分差異表達mi RNAs的生物信息學分析及mi R-146a-5p的靶基因驗證目的:探明差異表達mi RNAs在NASH相關肝纖維化中的靶基因及其生物學分析。方法:采用Target Scan、Pic Tar及mi Randa三種常用的靶基因預測軟件對差異表達的mi RNAs的靶基因進行預測。Gene Ontology(GO)對靶基因集合進行GO注釋描述,同時應用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路數(shù)據(jù)庫分析差異表達mi RNAs可能參與調(diào)節(jié)的信號通路。利用雙熒光素報告基因系統(tǒng)驗證mi R-146a-5p與其靶基因的靶向調(diào)節(jié)關系。結果:1生物信息學分析:對Target Scan、Pic Tar及mi Randa預測差異表達mi RNAs的靶基因進行GO分析結果顯示,差異表達mi RNAs靶基因的功能顯著富集于轉錄調(diào)控、轉錄酶活性、蛋白結合及磷酸化、Wnt信號通路及其負性調(diào)控等,而KEGG信號通路分析結果顯示差異表達的mi RNAs靶基因參與的信號通路顯著富集于胰島素信號通路、凋亡、Wnt信號通路、Toll樣受體信號通路及m TOR信號通路等。2 mi R-146a-5p的靶基因預測:應用三種miro RNA靶基因預測軟件(Target Scan、PITA和mi Randa)共同預測mi R-146a-5p的靶基因,其中Wnt1 3′非編碼區(qū)(3′-Untranslated Regions,3′-UTR)及Wnt5a 3′-UTR均存在mi R-146a-5p的結合位點。3靶基因驗證:雙熒光素酶報告基因顯示,與空白對照組相比,Wnt1基因3′-UTR野生型質(zhì)粒與mi R-146a-5p模擬物(mimics)共轉染293T細胞后,報告基因的熒光素酶活性顯著降低,與mi R-146a-5p抑制物(inhibitor)共轉染后,酶活性呈相反趨勢改變。而mi R-146a-5p mimics、mimics control、mi R-146a-5p inhibitor、inhibitor control對Wnt1基因3′-UTR突變型質(zhì)粒熒光素酶活性無明顯影響。4肝組織mi R-146a-5p靶基因表達:NASH相關肝纖維化小鼠肝組織中mi R-146a-5p靶基因Wnt1及Wnt5a蛋白較正常對照組顯著增多(p0.05),與mi R-146a-5p的表達負相關。結論:1 NASH相關肝纖維化肝組織中差異表達的mi RNAs可能通過調(diào)控多種生物學功能及信號通路而影響脂肪性肝纖維化的形成。2 mi R-146a-5p能與Wnt1 3’UTR及Wnt5a 3’UTR特異性結合,提示W(wǎng)nt1及Wnt5a為mi R-146a-5p的靶基因。第三部分mi R-146a-5p在NASH相關肝纖維化中的作用及機制研究目的:深入闡明mi R-146a-5p對肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)功能的調(diào)控,探明mi R-146a-5p對NASH相關肝纖維化發(fā)生發(fā)展的作用。方法:采用鏈霉蛋白酶-膠原酶遠未消化肝臟,經(jīng)Percoll密度梯度離心,分離小鼠原代HSC,分別培養(yǎng)1d、3d、7d。采用實時定量RT-PCR及Western blot檢測原代HSC活化過程中,mi R-146a-5p及靶基因的表達變化。應用肝星狀細胞系HSC-T6及LX-2細胞,將50n M mi R-146a-5p mimics及100n M inhibitor轉染HSC-T6細胞,采用CCK8(Cell Counting Kit 8)測定各組細胞活力,采用實時熒光定量PCR及Western-blot分析mi R-146a-5p及靶基因、肝纖維化相關基因m RNA及蛋白的表達情況;同時利用si RNA技術沉默Wnt1及Wnt5a,實時熒光定量PCR及Western-blot分析mi R-146a-5p及靶基因、肝纖維化相關基因m RNA及蛋白的表達情況。結果:1 HSC活化過程中mi R-146a-5p及靶基因的表達變化:在HSC培養(yǎng)1d、3d及7d,mi R-146a-5p表達隨HSC活化而逐漸降低,而靶基因Wnt1及Wnt5a的表達伴隨HSC活化而逐漸增加;2過表達mi R-146a-5p對HSC增殖的影響:CCK8結果顯示,轉染50μM mi R-146a-5p mimics后,HSC-T6的細胞活力明顯降低(P0.01);3過表達或抑制mi R-146a-5p對HSC活化及分泌膠原功能的影響;過表達mi R-146a-5p能夠顯著抑制α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、1型膠原(Collagen Type 1,Col-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)m RNA及蛋白的表達,而增加Smad7 m RNA及蛋白的表達(P0.01);抑制mi R-146a-5p的表達能夠明顯增加α-SMA、Col-1、MMP-2的表達,而抑制Smad7的表達(P0.01)。4過表達或抑制mi R-146a-5p對HSC內(nèi)靶基因Wnt1、Wnt5a及下游信號分子的影響:過表達mi R-146a-5p能夠明顯抑制靶基因Wnt1、Wnt5a蛋白的表達變化,而m RNA的表達無明顯差異,同時其下游β-catenin、NAFT5的表達顯著降低,而GSK-3β的表達顯著增加;抑制mi R-146a-5p能夠顯著增加靶基因Wnt1、Wnt5a蛋白的表達變化,而m RNA的表達無明顯差異,同時其下游β-catenin、NAFT5的表達顯著增加,而GSK-3β的表達顯著降低;5 si RNA沉默靶基因?qū)ο掠涡盘柾芳案卫w維化相關因子的影響:分別轉染si-Wnt1及si-Wnt5a后,Wnt1及Wnt5a的m RNA及蛋白表達水平顯著降低,同時其下游基因β-catenin、NAFT5的表達顯著降低,而GSK-3β的表達顯著增加,α-SMA、Col-1、MMP-2的表達明顯降低,而Smad7的表達則明顯增高。結論:1 mi R-146a-5p能夠抑制HSC的增殖、活化及膠原分泌;2 mi R-146a-5p能夠抑制HSC內(nèi)靶基因Wnt1、Wnt5a及Wnt信號通路。第四部分血紅素氧合酶-1靶向調(diào)控在NASH相關肝纖維化中對mi R-146a-5p及靶基因的影響目的:闡明靶向調(diào)控HO-1基因在NASH相關肝纖維化發(fā)病過程中對mi R-146a-5p及靶基因的影響。方法:采用HO-1激動劑血晶素(Hemin)及抑制劑鋅原卟啉(zinc protoporphyrin,Zn PP)腹腔注射干預NASH相關肝纖維化小鼠模型,觀察小鼠血清酶學改變及肝組織炎癥、脂肪變及纖維化程度;采用實時定量RT-PCR及Western blot檢測HO-1誘導或抑制對mi R-146a-5p、靶基因Wnt1、Wnt5a及Wnt信號通路關鍵分子、肝纖維化相關因子m RNA及蛋白的表達的影響。結果:1 HO-1對小鼠肝臟生化學的影響:HO-1激動劑Hemin能夠顯著降低MCD飲食喂養(yǎng)小鼠血清ALT、AST水平,而HO-1抑制劑Zn PP能夠進一步加重肝組織損傷,ALT、AST水平進一步增高。2 HO-1對小鼠肝組織病理學的影響:肝組織病理學顯示Hemin能夠明顯改善小鼠肝組織肝脂肪變、炎癥及纖維化,而Zn PP則加重小鼠肝損傷;3 HO-1對mi R-146a-5p、靶基因及其下游信號通路的影響:Hemin能夠明顯上調(diào)mi R-146a-5p表達,并下調(diào)其靶基因Wnt1、Wnt5a表達,同時調(diào)控下游信號分子β-catenin、GSK-3β及NAFT5的表達;而Zn PP能夠顯著下調(diào)mi R-146a-5p的表達,上調(diào)Wnt1、Wnt5a、β-catenin及NAFT5的表達,而下調(diào)GSK-3β的表達。結論:1 HO-1能夠減輕NASH相關肝纖維化肝損傷、炎癥及纖維化;2 HO-1能夠調(diào)控mi R-146a-5p及其靶基因的表達而參與NASH相關肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575

【參考文獻】

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本文編號：2236343