【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是近年發(fā)病率逐漸增加的慢性肝臟疾病,屬于代謝異常相關(guān)性肝病,包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH),可進(jìn)展為肝硬化或并發(fā)肝細(xì)胞癌,嚴(yán)重危害人類健康,因此,NAFLD早期診斷及有效治療是防止進(jìn)展為終末期肝病的重要措施。肝穿刺活檢是目前診斷NAFLD的可靠方法,但由于為創(chuàng)傷性檢查,臨床應(yīng)用有一定局限性。NASH相關(guān)肝纖維化是NAFLD疾病譜中重要的病理階段,探明其發(fā)病機(jī)制,尋求特異有效的分子診斷標(biāo)志及治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。Micro RNAs(mi RNAs)是長(zhǎng)約19-25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA,由70-100nt雙鏈莖環(huán)前體經(jīng)RNA酶Dicer合成,能夠識(shí)別靶m RNA的3’端非編碼區(qū)(3’-untranslated region,3′-UTR),導(dǎo)致翻譯阻遏或m RNA降解。近年來研究表明mi RNAs在NAFLD發(fā)病過程中存在差異表達(dá),而有關(guān)mi RNAs對(duì)NASH相關(guān)肝纖維化的影響研究甚少。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)是肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時(shí),阻止炎癥反應(yīng),發(fā)揮保護(hù)氧化組織損傷的關(guān)鍵基因,而HO-1在NASH相關(guān)肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中對(duì)mi RNA的作用至今未見報(bào)道。本研究通過建立NASH相關(guān)肝纖維化動(dòng)物模型,應(yīng)用基因芯、生物信息學(xué)、雙熒光素酶報(bào)告基因、原代細(xì)胞分離培養(yǎng)及si RNA轉(zhuǎn)染等技術(shù)方法,闡明mi RNAs對(duì)NASH相關(guān)肝纖維化的作用及機(jī)制。并進(jìn)一步探討HO-1的靶向調(diào)控對(duì)關(guān)鍵mi RNA的影響,觀察HO-1是否能夠通過調(diào)節(jié)相關(guān)mi RNA發(fā)揮對(duì)脂肪性肝纖維化的調(diào)控作用,為該病的病因探索及疾病防治提供新思路。第一部分NASH相關(guān)肝纖維化小鼠肝組織差異表達(dá)mi RNAs的篩選與驗(yàn)證目的:篩選及驗(yàn)證NASH相關(guān)肝纖維化小鼠肝組織差異表達(dá)的mi RNAs。方法:選用8周齡雄性C57BL/6J小鼠,采用膽堿-蛋氨酸缺乏(methionine-choline deficient,MCD)飲食建立NASH相關(guān)肝纖維化小鼠模型,觀察小鼠肝臟生化學(xué)及肝組織病理學(xué)變化,采用Western blot技術(shù)檢測(cè)小鼠肝組織纖維化相關(guān)因子的表達(dá)變化,利用LC Sciences micro RNA Microarray-20.0 Mouse mi RNA基因表達(dá)譜芯片篩選NASH相關(guān)肝纖維化差異表達(dá)mi RNAs,并采用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:MCD飲食建立NASH相關(guān)肝纖維化小鼠模型1肝臟生化學(xué)變化:NASH相關(guān)肝纖維化小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)顯著高于對(duì)照組,P0.05。2肝臟組織病理學(xué)特征:NASH相關(guān)肝纖維化小鼠肝組織切片呈現(xiàn)肝細(xì)胞大泡性脂肪變性,伴點(diǎn)灶狀壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn),可見竇周纖維化及匯管區(qū)擴(kuò)大。3肝組織纖維化相關(guān)因子的表達(dá)變化:Western blot結(jié)果顯示,MCD組小鼠肝組織纖維化相關(guān)基因的表達(dá)變化與肝損傷程度相一致,伴隨肝損傷程度的不斷加重,纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factorβ1,TGF-β1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Smad4、4型膠原(Collagen Type 4,Col-4)、基質(zhì)金屬蛋白酶2/9(matrixmetallo-proteinase-2/9,MMP-2/9)的表達(dá)顯著增加,而基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP-1)、Smad7得表達(dá)顯著降低。4 mi RNAs芯片結(jié)果:采用mi RNAs芯片篩選NASH相關(guān)肝纖維化肝組織中差異表達(dá)mi RNAs,篩選出37個(gè)差異表達(dá)mi RNAs,其中表達(dá)上調(diào)19個(gè)(mi R-15b-5p、mi R-150-5p、mi R-106a-5p等),下調(diào)18個(gè)(mi R-146a-5p、mi R-203-3p、mi R-130a-3p等)。5差異表達(dá)mi RNAs的驗(yàn)證:應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè),結(jié)果顯示NASH相關(guān)肝纖維化小鼠肝組織中mi R-15b-5p表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào),而mi R-146a-5p及mi R-203-3p表達(dá)明顯下調(diào),尤以mi R-146a-5p下調(diào)顯著,與芯片結(jié)果一致(P0.05)。結(jié)論:1 NASH相關(guān)肝纖維化小鼠肝組織中mi RNAs差異表達(dá)明顯,提示mi RNAs可能參與了該病的發(fā)病過程。2 mi R-146a-5p在MCD組小鼠的肝組織中表達(dá)較正常對(duì)照組小鼠明顯降低,提示mi R-146a-5p可能參與了NASH相關(guān)肝纖維化的調(diào)控。第二部分差異表達(dá)mi RNAs的生物信息學(xué)分析及mi R-146a-5p的靶基因驗(yàn)證目的:探明差異表達(dá)mi RNAs在NASH相關(guān)肝纖維化中的靶基因及其生物學(xué)分析。方法:采用Target Scan、Pic Tar及mi Randa三種常用的靶基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)差異表達(dá)的mi RNAs的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。Gene Ontology(GO)對(duì)靶基因集合進(jìn)行GO注釋描述,同時(shí)應(yīng)用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)mi RNAs可能參與調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。利用雙熒光素報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證mi R-146a-5p與其靶基因的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。結(jié)果:1生物信息學(xué)分析:對(duì)Target Scan、Pic Tar及mi Randa預(yù)測(cè)差異表達(dá)mi RNAs的靶基因進(jìn)行GO分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)mi RNAs靶基因的功能顯著富集于轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄酶活性、蛋白結(jié)合及磷酸化、Wnt信號(hào)通路及其負(fù)性調(diào)控等,而KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示差異表達(dá)的mi RNAs靶基因參與的信號(hào)通路顯著富集于胰島素信號(hào)通路、凋亡、Wnt信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路及m TOR信號(hào)通路等。2 mi R-146a-5p的靶基因預(yù)測(cè):應(yīng)用三種miro RNA靶基因預(yù)測(cè)軟件(Target Scan、PITA和mi Randa)共同預(yù)測(cè)mi R-146a-5p的靶基因,其中Wnt1 3′非編碼區(qū)(3′-Untranslated Regions,3′-UTR)及Wnt5a 3′-UTR均存在mi R-146a-5p的結(jié)合位點(diǎn)。3靶基因驗(yàn)證:雙熒光素酶報(bào)告基因顯示,與空白對(duì)照組相比,Wnt1基因3′-UTR野生型質(zhì)粒與mi R-146a-5p模擬物(mimics)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,報(bào)告基因的熒光素酶活性顯著降低,與mi R-146a-5p抑制物(inhibitor)共轉(zhuǎn)染后,酶活性呈相反趨勢(shì)改變。而mi R-146a-5p mimics、mimics control、mi R-146a-5p inhibitor、inhibitor control對(duì)Wnt1基因3′-UTR突變型質(zhì)粒熒光素酶活性無(wú)明顯影響。4肝組織mi R-146a-5p靶基因表達(dá):NASH相關(guān)肝纖維化小鼠肝組織中mi R-146a-5p靶基因Wnt1及Wnt5a蛋白較正常對(duì)照組顯著增多(p0.05),與mi R-146a-5p的表達(dá)負(fù)相關(guān)。結(jié)論:1 NASH相關(guān)肝纖維化肝組織中差異表達(dá)的mi RNAs可能通過調(diào)控多種生物學(xué)功能及信號(hào)通路而影響脂肪性肝纖維化的形成。2 mi R-146a-5p能與Wnt1 3’UTR及Wnt5a 3’UTR特異性結(jié)合,提示W(wǎng)nt1及Wnt5a為mi R-146a-5p的靶基因。第三部分mi R-146a-5p在NASH相關(guān)肝纖維化中的作用及機(jī)制研究目的:深入闡明mi R-146a-5p對(duì)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)功能的調(diào)控,探明mi R-146a-5p對(duì)NASH相關(guān)肝纖維化發(fā)生發(fā)展的作用。方法:采用鏈霉蛋白酶-膠原酶遠(yuǎn)未消化肝臟,經(jīng)Percoll密度梯度離心,分離小鼠原代HSC,分別培養(yǎng)1d、3d、7d。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blot檢測(cè)原代HSC活化過程中,mi R-146a-5p及靶基因的表達(dá)變化。應(yīng)用肝星狀細(xì)胞系HSC-T6及LX-2細(xì)胞,將50n M mi R-146a-5p mimics及100n M inhibitor轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞,采用CCK8(Cell Counting Kit 8)測(cè)定各組細(xì)胞活力,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western-blot分析mi R-146a-5p及靶基因、肝纖維化相關(guān)基因m RNA及蛋白的表達(dá)情況;同時(shí)利用si RNA技術(shù)沉默Wnt1及Wnt5a,實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western-blot分析mi R-146a-5p及靶基因、肝纖維化相關(guān)基因m RNA及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1 HSC活化過程中mi R-146a-5p及靶基因的表達(dá)變化:在HSC培養(yǎng)1d、3d及7d,mi R-146a-5p表達(dá)隨HSC活化而逐漸降低,而靶基因Wnt1及Wnt5a的表達(dá)伴隨HSC活化而逐漸增加;2過表達(dá)mi R-146a-5p對(duì)HSC增殖的影響:CCK8結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染50μM mi R-146a-5p mimics后,HSC-T6的細(xì)胞活力明顯降低(P0.01);3過表達(dá)或抑制mi R-146a-5p對(duì)HSC活化及分泌膠原功能的影響;過表達(dá)mi R-146a-5p能夠顯著抑制α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、1型膠原(Collagen Type 1,Col-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)m RNA及蛋白的表達(dá),而增加Smad7 m RNA及蛋白的表達(dá)(P0.01);抑制mi R-146a-5p的表達(dá)能夠明顯增加α-SMA、Col-1、MMP-2的表達(dá),而抑制Smad7的表達(dá)(P0.01)。4過表達(dá)或抑制mi R-146a-5p對(duì)HSC內(nèi)靶基因Wnt1、Wnt5a及下游信號(hào)分子的影響:過表達(dá)mi R-146a-5p能夠明顯抑制靶基因Wnt1、Wnt5a蛋白的表達(dá)變化,而m RNA的表達(dá)無(wú)明顯差異,同時(shí)其下游β-catenin、NAFT5的表達(dá)顯著降低,而GSK-3β的表達(dá)顯著增加;抑制mi R-146a-5p能夠顯著增加靶基因Wnt1、Wnt5a蛋白的表達(dá)變化,而m RNA的表達(dá)無(wú)明顯差異,同時(shí)其下游β-catenin、NAFT5的表達(dá)顯著增加,而GSK-3β的表達(dá)顯著降低;5 si RNA沉默靶基因?qū)ο掠涡盘?hào)通路及肝纖維化相關(guān)因子的影響:分別轉(zhuǎn)染si-Wnt1及si-Wnt5a后,Wnt1及Wnt5a的m RNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低,同時(shí)其下游基因β-catenin、NAFT5的表達(dá)顯著降低,而GSK-3β的表達(dá)顯著增加,α-SMA、Col-1、MMP-2的表達(dá)明顯降低,而Smad7的表達(dá)則明顯增高。結(jié)論:1 mi R-146a-5p能夠抑制HSC的增殖、活化及膠原分泌;2 mi R-146a-5p能夠抑制HSC內(nèi)靶基因Wnt1、Wnt5a及Wnt信號(hào)通路。第四部分血紅素氧合酶-1靶向調(diào)控在NASH相關(guān)肝纖維化中對(duì)mi R-146a-5p及靶基因的影響目的:闡明靶向調(diào)控HO-1基因在NASH相關(guān)肝纖維化發(fā)病過程中對(duì)mi R-146a-5p及靶基因的影響。方法:采用HO-1激動(dòng)劑血晶素(Hemin)及抑制劑鋅原卟啉(zinc protoporphyrin,Zn PP)腹腔注射干預(yù)NASH相關(guān)肝纖維化小鼠模型,觀察小鼠血清酶學(xué)改變及肝組織炎癥、脂肪變及纖維化程度;采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blot檢測(cè)HO-1誘導(dǎo)或抑制對(duì)mi R-146a-5p、靶基因Wnt1、Wnt5a及Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子、肝纖維化相關(guān)因子m RNA及蛋白的表達(dá)的影響。結(jié)果:1 HO-1對(duì)小鼠肝臟生化學(xué)的影響:HO-1激動(dòng)劑Hemin能夠顯著降低MCD飲食喂養(yǎng)小鼠血清ALT、AST水平,而HO-1抑制劑Zn PP能夠進(jìn)一步加重肝組織損傷,ALT、AST水平進(jìn)一步增高。2 HO-1對(duì)小鼠肝組織病理學(xué)的影響:肝組織病理學(xué)顯示Hemin能夠明顯改善小鼠肝組織肝脂肪變、炎癥及纖維化,而Zn PP則加重小鼠肝損傷;3 HO-1對(duì)mi R-146a-5p、靶基因及其下游信號(hào)通路的影響:Hemin能夠明顯上調(diào)mi R-146a-5p表達(dá),并下調(diào)其靶基因Wnt1、Wnt5a表達(dá),同時(shí)調(diào)控下游信號(hào)分子β-catenin、GSK-3β及NAFT5的表達(dá);而Zn PP能夠顯著下調(diào)mi R-146a-5p的表達(dá),上調(diào)Wnt1、Wnt5a、β-catenin及NAFT5的表達(dá),而下調(diào)GSK-3β的表達(dá)。結(jié)論:1 HO-1能夠減輕NASH相關(guān)肝纖維化肝損傷、炎癥及纖維化;2 HO-1能夠調(diào)控mi R-146a-5p及其靶基因的表達(dá)而參與NASH相關(guān)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2236343