【摘要】：研究背景和目的： 腸道在機體中是獨特的，從出生開始就被大量的微生物定植，尤其是細菌。粘液作為宿主-細菌相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)，，是管腔微生物與底層的免疫細胞之間的重要屏障。腸道粘液主要成分是粘蛋白2（MUC2），粘蛋白家族的一個重要組成成員。小鼠缺乏Muc2將導(dǎo)致結(jié)腸粘液層缺乏，但不會限制細菌附著到粘膜組織，這可能在小鼠的成長中導(dǎo)致嚴重的自發(fā)性結(jié)腸炎和結(jié)直腸癌。高分子質(zhì)量的O-連接糖蛋白作為粘蛋白的主要成分，廣泛表達于人體各個部位，并在生理和病理過程中扮演著許多重要的角色。粘蛋白型O-glycans主要包含Core1，Core2，Core3和Core4四種不同的類型。Core1O-glycans是主要的O-glycans，在大多數(shù)組織中表達。缺失Core1O-glycans嚴重損壞了小鼠腸道粘液層的形成，并誘發(fā)自發(fā)性腸道炎癥。但是O-glycans如何促進粘液屏障的完整性，以及與腸道菌群相互作用維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)仍不清楚。本研究用芐基-N-乙�；�-α-D-半乳糖胺（benzyl-α-GalNAc）來處理結(jié)腸癌上皮細胞HT-29及其分化型細胞HT-29-Gal，觀察腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicEscherichia coli serotvpe O157:H7or EHEC O157:H7)和腸致病性大腸桿菌(enteropathogenic Escherichia coli or EPEC)對腸上皮細胞粘附行為的改變；對HT-29細胞進行Core1合酶（C1GALT1）的RNA干擾，并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，為進一步觀察Core1合酶抑制的腸上皮細胞與細菌的粘附創(chuàng)造必要的條件。通過研究粘蛋白分子上O-glycans與病原微生物之間的相互作用，幫助我們理解目前患病率日益增加的炎癥性腸病的發(fā)生機制。 方法： 1.將結(jié)腸癌上皮細胞HT-29進行半乳糖誘導(dǎo)，得到分化型細胞HT-29-Gal。 2．將HT-29和促分化型HT-29-Gal細胞用benzyl-α-GalNAc處理，得到O型糖鏈合成抑制的命名為HT-29-OBN和HT-29-Gal-OBN的細胞。 3．采用Western blot和Real-time PCR方法檢測腸分化細胞HT-29-Gal和benzyl-α-GalNAc處理得到的HT-29-OBN和HT-29-Gal-OBN細胞中MUC2的表達情況。 4．將HT-29，HT-29-Gal，HT-29-OBN和HT-29-Gal-OBN四種細胞分別與大腸桿菌EHEC O157:H7和EPEC共培養(yǎng)，采用系列稀釋菌落計數(shù)法和免疫熒光染色法觀察細菌在上述四種細胞表面的粘附情況。 5.構(gòu)建Core1合酶（C1GALT1）的干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Core1合酶高表達的HT-29細胞，并進行G418篩選。 結(jié)果： 1. Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示，相對于HT-29和HT-29-Gal細胞，經(jīng)benzyl-α-GalNAc處理后的HT-29-OBN和HT-29-Gal-OBN細胞中MUC2的蛋白和mRNA表達水平均明顯減低。 2. HT-29-Gal-OBN和HT-29-OBN細胞與大腸桿菌EHEC O157:H7或EPEC的粘附明顯少于對應(yīng)的HT-29-Gal和HT-29細胞。 3.獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的C1GALT1沉默的HT-29細胞。 結(jié)論： 抑制腸上皮細胞O型糖鏈的合成，減少了細胞MUC2的表達及其細菌的粘附。
[Abstract]:Background and objective: the gut is unique in the body and has been colonized by a large number of microorganisms, especially bacteria. As the key medium of host-bacteria interaction, mucus is an important barrier between lumen microbes and underlying immune cells. Intestinal mucus is mainly composed of mucin 2 (MUC2), an important member of mucin family. Lack of Muc2 in mice leads to mucous layer deficiency in colon, but does not restrict bacterial adhesion to mucous tissue, which may lead to severe spontaneous colitis and colorectal cancer in mice. As the main component of mucin, polymer mass O-ligand glycoprotein is widely expressed in various parts of human body and plays many important roles in physiological and pathological processes. Mucin type O-glycans mainly contains four different types of Core1,Core2,Core3 and Core4. Core1O-glycans is the main O-glycans and expressed in most tissues. The absence of Core1O-glycans seriously damaged the formation of mucus layer and induced spontaneous intestinal inflammation in mice. However, it is unclear how O-glycans promotes the integrity of mucus barrier and maintains the homeostasis of intestinal environment by interacting with intestinal flora. In this study, benzyl- 偽 -galactosamine (benzyl- 偽 -GalNAc) was used to treat HT-29 of colon cancer epithelial cells and differentiated HT-29-Gal, cells to observe (enterohemorrhagicEscherichia coli serotvpe O157:H7or EHEC O157:H7 and (enteropathogenic Escherichia coli or EPEC) of enterogenic Escherichia coli. The change of cell adhesion behavior; The RNA interference of Core1 synthase (C1GALT1) was carried out on HT-29 cells and a stable transfected cell line was established to create necessary conditions for further observation of the adhesion of intestinal epithelial cells inhibited by Core1 synthase to bacteria. By studying the interaction between O-glycans and pathogenic microorganisms on mucin molecules, we can understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD), which has a growing prevalence. Methods: 1. HT-29 of colon cancer epithelial cells was induced by galactose to obtain differentiated cells HT-29-Gal. 2. HT-29 and HT-29-Gal cells were treated with benzyl- 偽 -GalNAc. 3. The expression of MUC2 in HT-29-Gal and benzyl- 偽 -GalNAc treated with HT-29-Gal and benzyl- 偽 -GalNAc was detected by Western blot and Real-time PCR methods. 4. Four kinds of cells of HT-29,HT-29-Gal,HT-29-OBN and HT-29-Gal-OBN were co-cultured with Escherichia coli EHEC O157:H7 and EPEC, respectively. A series of dilution colony counting and immunofluorescence staining methods were used to observe the adhesion of bacteria to the above four cell surfaces. 5. 5. The interfering plasmid of Core1 synthase (C1GALT1) was constructed and transfected into HT-29 cells with high expression of Core1 synthase and screened by G418. Results: 1. The results of Western blot and Real-time PCR showed that the expression of MUC2 protein and mRNA in HT-29-OBN and HT-29-Gal-OBN cells treated with benzyl- 偽 -GalNAc was significantly lower than that in HT-29 and HT-29-Gal cells. The adhesion of HT-29-Gal-OBN and HT-29-OBN cells to Escherichia coli EHEC O157:H7 or EPEC was significantly lower than that of corresponding HT-29-Gal and HT-29 cells. Stable transfected C1GALT1 silenced HT-29 cells were obtained. Conclusion: inhibiting the synthesis of O-type sugar chain in intestinal epithelial cells and reducing the expression of MUC2 and the adhesion of bacteria.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R574

【共引文獻】

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2 葉鈞;宋麗麗;劉韻;田音;潘瓊;彭志紅;汪榮泉;;腸分化細胞黏蛋白O-型糖鏈合成抑制導(dǎo)致MUC2表達減低以及對細菌侵襲易感[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2013年19期

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4 莊則豪,王立東,高珊珊,范宗民,宋子博,齊義軍,李燕杰,李吉學(xué);河南食管癌高發(fā)區(qū)食管和賁門癌組織中粘蛋白1的表達[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2002年06期

5 向松濤,周四維;粘蛋白在膀胱癌診斷和治療中應(yīng)用的研究進展[J];臨床泌尿外科雜志;2002年03期

6 周兵,李家邦,戴幸平;黏蛋白與胃黏膜屏障[J];臨床消化病雜志;2005年03期

7 向松濤,周四維,管維,王勤章,張保,劉繼紅,葉章群;腫瘤浸潤性樹突狀細胞與粘蛋白MUC1在前列腺癌與前列腺增生中的表達研究[J];中華男科學(xué);2003年07期

8 宋麗麗;葉鈞;劉韻;潘瓊;鐘小莉;李姍姍;田音;彭志紅;汪榮泉;;O型糖鏈合成阻滯對腸上皮細胞MUC2表達及細菌黏附的抑制作用[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2013年10期

9 向松濤;周四維;管維;張旭;劉繼紅;莊乾元;葉章群;;糖蛋白(MUC1與MUC7)基因在膀胱移行細胞癌的表達研究[J];中華實驗外科雜志;2006年02期

10 Yoshinori Inagaki;Norihiro Kokudo;Yasuji Seyama;Munehiro Nakata;Hiroshi Imamura;Keiji Sano;Yasuhiko Sugawara;Masatoshi Makuuchi;;KL-6 mucin expression in carcinoma of the ampulla of Vater: Association with cancer progression[J];World Journal of Gastroenterology;2005年35期

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3 許煥麗;“KL-6 mucin”在消化系統(tǒng)腫瘤中的表達、臨床意義及機制研究[D];山東大學(xué);2010年

4 王培培;動物組織中微量糖鏈結(jié)構(gòu)分析方法的建立及應(yīng)用[D];中國海洋大學(xué);2012年

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3 李姝;Cdx2和MUC2在反流性食管炎、Barrett食管和食管腺癌中的表達[D];天津醫(yī)科大學(xué);2005年

4 張君華;ST3GalV（GM3合成酶）與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系的研究[D];中國海洋大學(xué);2006年

5 葛宇清;O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶對小鼠乳腺癌細胞遷移的影響[D];中國海洋大學(xué);2007年

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7 李飛;甘草甜素對人膀胱癌細胞T24的抑制作用及其機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2010年

8 陳建平;β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中的表達及意義[D];南通大學(xué);2009年

9 董婷婷;降解草酸益生菌的篩選及其對實驗動物的功效研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2012年

10 朱影;ST6Gal-I通過上調(diào)整合素β1的唾液酸化促進絨毛膜癌細胞的遷移[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號：2228599