【摘要】：中國(guó)肝硬化人口十分龐大，而門(mén)脈高壓是肝硬化失代償期患者典型的臨床表現(xiàn)，又是肝硬化多種并發(fā)癥發(fā)生的根源及致死的主因。對(duì)門(mén)脈高壓進(jìn)行積極有效防治是改善患者預(yù)后及降低病死率的關(guān)鍵，但目前尚無(wú)理想的口服藥物來(lái)預(yù)防門(mén)脈高壓。 奧曲肽（octreotide, OCT）是目前公認(rèn)的治療肝硬化門(mén)脈高壓的有效藥物，雖可抵抗胃腸道中酸、酶的降解，但因分子量大，脂溶性差，受腸粘膜屏障和肝腸首過(guò)效應(yīng)的影響，口服生物利用度極低，臨床上僅限于注射給藥，不利于作為預(yù)防性藥物長(zhǎng)期應(yīng)用。OCT口服可以避免長(zhǎng)期反復(fù)注射給藥帶來(lái)的痛苦和不便，臨床意義重大。我們期待能像治療高血壓一樣，實(shí)現(xiàn)OCT口服，達(dá)到早期、持續(xù)服藥來(lái)防治門(mén)脈高壓。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此做了大量工作，但仍無(wú)任何一項(xiàng)研究成果可應(yīng)用于臨床。 本課題組前期實(shí)驗(yàn)建立了部分門(mén)脈結(jié)扎的門(mén)脈高壓大鼠模型，證實(shí)廣泛側(cè)支循環(huán)的建立可有效地降低OCT肝首過(guò)效應(yīng)，故肝首過(guò)效應(yīng)并非門(mén)脈高壓下OCT口服吸收的主要障礙。隨后，又進(jìn)一步研究了肝硬化門(mén)脈高壓狀態(tài)時(shí)空腸首過(guò)效應(yīng)中起著關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白（p-glycoprotein, P-gp）、多耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistance-associated protein2, MRP2）和代謝酶細(xì)胞色素P4503A4（cytochrome P4503A4, CYP3A4），探討了抑制腸上皮首過(guò)效應(yīng)來(lái)增加OCT腸吸收的機(jī)制，故腸上皮首過(guò)效應(yīng)問(wèn)題也可得到解決。而對(duì)于OCT腸吸收至關(guān)重要的胞旁吸收途徑則是本次研究的重點(diǎn)。本研究通過(guò)對(duì)肝硬化門(mén)脈高壓大鼠空腸粘膜的形態(tài)學(xué)及分子水平的研究表明，門(mén)脈高壓狀態(tài)時(shí)空腸上皮緊密連接（tightjunction, TJ）蛋白Claudin-1表達(dá)減少，TJ松弛，腸粘膜屏障功能破壞，可使腸壁通透性增加，利于OCT的腸吸收。而通過(guò)Caco-2細(xì)胞模型證實(shí)促吸收劑青藤堿（sinomenine, SN）能夠通過(guò)激活蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)調(diào)控TJ蛋白Claudin-1的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)短暫可逆的調(diào)節(jié)胞旁TJ，有效提高OCT在Caco-2細(xì)胞單層中的滲透率。預(yù)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)SN能夠增加正常大鼠OCT的腸吸收率，本研究則進(jìn)一步在肝硬化門(mén)脈高壓大鼠體內(nèi)及體外吸收模型上證實(shí)SN有效的提高了OCT口服生物利用度，且在肝硬化門(mén)脈高壓狀態(tài)時(shí)其促吸收效果更為顯著。 本研究旨在通過(guò)細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，揭示SN可逆性調(diào)控胞旁TJ促進(jìn)OCT腸吸收的機(jī)制，為提高OCT口服生物利用度提供有效可行的方法及途徑，為OCT臨床合理用藥提供理論依據(jù)，為實(shí)現(xiàn)口服OCT預(yù)防門(mén)脈高壓開(kāi)創(chuàng)新紀(jì)元。 本研究共分三部分 第一部分青藤堿可逆調(diào)控腸上皮細(xì)胞緊密連接促奧曲肽吸收的機(jī)制研究 第二部分肝硬化門(mén)脈高壓對(duì)大鼠空腸上皮細(xì)胞緊密連接影響的研究 第三部分肝硬化門(mén)脈高壓時(shí)青藤堿促奧曲肽空腸吸收研究 第一部分 青藤堿可逆調(diào)控腸上皮細(xì)胞緊密連接促奧曲肽吸收的機(jī)制研究 目的：在Caco-2細(xì)胞單層模型上評(píng)估SN對(duì)OCT腸吸收的影響，明確SN可逆調(diào)控腸上皮細(xì)胞TJ的分子機(jī)制。 方法：1.建立Caco-2細(xì)胞單層模型，并通過(guò)形態(tài)學(xué)、跨膜電阻（transepithelialelectrical resistance, TEER）測(cè)量及胞旁漏出標(biāo)記物異硫氰酸熒光素標(biāo)記的右旋糖酐-4000（FD-4）的滲透量來(lái)考察Caco-2細(xì)胞單層的完整性。 2.通過(guò)乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）試驗(yàn)考察不同濃度組（0.5%、1%、2%w/v) SN對(duì)Caco-2細(xì)胞單層的損傷情況。 3.通過(guò)TEER的測(cè)量及FD-4滲透量的計(jì)算明確SN對(duì)TJ的可逆性調(diào)節(jié)作用。 4. SN對(duì)OCT腸吸收的影響。分組：Control組（10μM OCT）；SN組（0.5%SN+10μM OCT）�？疾旄鹘MOCT的表觀滲透系數(shù)（apparent permeability coefficient,Papp）。 5. SN對(duì)TJ蛋白Claudin-1表達(dá)的影響。分組為：Control組；SN組（0.5%SN）、SN去除組（SN removal）及PKC抑制劑組(0.5%SN+10μM Ro318220)。運(yùn)用蛋白免疫印跡（western blot）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-Time-PolymeraseChain Reaction, Real-Time-PCR）、免疫熒光染色（Immunofluorescent Staining, IF）方法分別考察各組中Claudin-1的表達(dá)。 6. SN對(duì)PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。分組：Control組，SN組（0.5%SN），運(yùn)用western blot的方法分別考察PKC-α在對(duì)照組及SN組中細(xì)胞膜及胞漿中的表達(dá)。 結(jié)果：1.細(xì)胞培養(yǎng)21天后，倒置顯微鏡可見(jiàn)細(xì)胞之間的接觸；經(jīng)過(guò)測(cè)量和計(jì) 算，Caco-2細(xì)胞單層的TEER值均達(dá)到700Ω·cm2以上；1mg/ml的FD-4在120min 內(nèi)的滲透量（AP-BL側(cè)）無(wú)明顯變化，一直處于較低水平（0.5pmol/cm2），說(shuō)明細(xì)胞間已形成完整的TJ。 2. LDH試驗(yàn)顯示120min后，中濃度組（1%）及高濃度組（2%）的SN對(duì)細(xì)胞均有損傷，與對(duì)照組相比P0.05；而低濃度組（0.5%）SN對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯損傷，與對(duì)照組相比P0.05。 3.0.5%SN作用120min時(shí)，TEER%降至最低點(diǎn)，為起始TEER值的43%，F(xiàn)D-4的流出量達(dá)到最高，與對(duì)照組相比，P0.05；去除SN的作用后，TEER%又迅速回升，在SN去除120min（總時(shí)間的240min）時(shí)恢復(fù)到起始水平，與對(duì)照組相比，P0.05。 4.共同給予0.5%SN和10μM OCT120min時(shí)，OCT的Papp為5.89±0.038×106cm/s，是對(duì)照組（單給10μM OCT）的2.2倍（P0.05）。 5. IF顯示Control組中Claudin-1蛋白均勻表達(dá)于細(xì)胞膜，顯示較強(qiáng)的綠色熒光；0.5%SN作用120min后，綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱，細(xì)胞間的連接出現(xiàn)斷斷續(xù)續(xù)的改變；去除SN120min時(shí)，細(xì)胞膜上的綠色熒光再次增強(qiáng)，細(xì)胞間的TJ完整性又恢復(fù)；而在SN+Ro318220共同作用120min時(shí)，細(xì)胞膜上的綠色熒光強(qiáng)度及細(xì)胞間TJ形態(tài)較給藥前無(wú)明顯變化。Western blot及Real-Time-PCR結(jié)果顯示，0.5%SN組較Control組Claudin-1蛋白表達(dá)明顯降低（P0.05），SN removal組及0.5%SN+10μM Ro318220組Claudin-1蛋白表達(dá)均較Control組無(wú)明顯差異（P0.05）。 6.對(duì)照組中，PKC-α蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞膜上表達(dá)量很少；而0.5%SN組，PKC-α則從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移出來(lái)，主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，表達(dá)量與Control組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，這種PKC-α的轉(zhuǎn)膜現(xiàn)象意味著PKC通路的激活。 結(jié)論：1.在Caco-2單層細(xì)胞模型上，SN能夠促進(jìn)OCT的吸收。 2. TJ蛋白Claudin-1在SN可逆性調(diào)控TJ中發(fā)揮著重要作用，且很可能與PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。 第二部分 肝硬化門(mén)脈高壓對(duì)大鼠空腸上皮細(xì)胞緊密連接影響的研究 目的：在肝硬化門(mén)脈高壓大鼠模型上，從形態(tài)學(xué)及分子水平對(duì)OCT胞旁吸收途徑的主要結(jié)構(gòu)—TJ進(jìn)行研究，探討肝硬化門(mén)脈高壓對(duì)腸粘膜屏障的影響及機(jī)制。 方法：大鼠肝硬化門(mén)脈高壓模型采用膽總管結(jié)扎（bile duct ligation, BDL）方法來(lái)制備。將健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機(jī)分為2組，即Control和BDL組。BDL術(shù)后4周，對(duì)2組大鼠進(jìn)行門(mén)靜脈壓力測(cè)定，之后處死大鼠，取血、取肝、取空腸，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase, ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)水平；HE染色觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)；透射電鏡（transmission electron microscope,TEM）觀察空腸上皮細(xì)胞間TJ形態(tài)；免疫組織化學(xué)染色（ImmunohistochemistryStaining, IHC）、western blot及Real-Time-PCR方法觀察大鼠空腸Claudin-1蛋白及基因表達(dá)情況。 結(jié)果：1.大鼠門(mén)脈壓力比較，BDL組較Control組明顯升高（P0.01）；對(duì)比ALT和AST值，BDL組較Control組明顯升高(P0.01)。 2.大鼠肝臟HE染色結(jié)果顯示BDL組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，大量纖維組織增生，炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，見(jiàn)多個(gè)假小葉，，小葉間膽管增生明顯。 3．TEM觀察顯示BDL大鼠空腸上皮細(xì)胞間TJ松弛，細(xì)胞間隙增寬。 4. IHC及western blot結(jié)果顯示BDL組Claudin-1蛋白表達(dá)較Control組降低（P0.01）；Real-Time-PCR方法顯示BDL組Claudin-1基因表達(dá)較Control組降低（P0.01）。 結(jié)論：肝硬化門(mén)脈高壓大鼠空腸粘膜超微結(jié)構(gòu)改變，TJ蛋白Claudin-1表達(dá)減少，TJ松弛，為增加OCT的胞旁滲透提供了可能。 第三部分肝硬化門(mén)脈高壓時(shí)青藤堿促奧曲肽空腸吸收研究 目的：通過(guò)肝硬化門(mén)脈高壓大鼠離體翻轉(zhuǎn)腸、腸灌流及灌胃給藥等多種藥物吸收模型，明確SN在門(mén)脈高壓狀態(tài)時(shí)對(duì)OCT腸吸收的促進(jìn)作用。 方法：1.建立BDL大鼠模型，運(yùn)用離體翻轉(zhuǎn)腸實(shí)驗(yàn)，考察SN對(duì)漿膜側(cè)OCT濃度影響。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分組及給藥濃度如下（n=4）：Control+OCT組：?jiǎn)谓o10μMOCT；Control+OCT+SN組：給予10μM OCT+0.5%SN；BDL+OCT組：?jiǎn)谓o10μMOCT；BDL+OCT+SN組：給予10μM OCT+0.5%SN。 2.運(yùn)用大鼠在體空腸灌流實(shí)驗(yàn)，考察SN對(duì)血中OCT濃度影響。分組及給藥濃度同翻轉(zhuǎn)腸實(shí)驗(yàn)。 3.通過(guò)大鼠灌胃實(shí)驗(yàn)，考察SN對(duì)OCT生物利用度的影響。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分組及給藥濃度如下（n=4）：Control+OCT靜脈給藥組：每只大鼠單給OCT20μg；Control+OCT口服給藥組：每只大鼠單給OCT200μg；Control+OCT+SN口服給藥組：每只大鼠給予OCT200μg+SN30mg；BDL+OCT靜脈給藥組：每只大鼠單給OCT20μg；BDL+OCT口服給藥組：每只大鼠單給OCT200μg；BDL+OCT+SN口服給藥組：每只大鼠給予OCT200μg+SN30mg。 結(jié)果：1.離體翻轉(zhuǎn)腸實(shí)驗(yàn)，對(duì)比OCT濃度，BDL+OCT+SN組較BDL+OCT組明顯升高(P0.05)；Control+OCT+SN組較Control+OCT組明顯升高(P0.05)；BDL+OCT+SN組較Control+OCT+SN組也有所升高(P0.05)； BDL+OCT組與Control+OCT組無(wú)明顯差異(P0.05)。 2.體空腸灌流實(shí)驗(yàn)，對(duì)比OCT濃度，結(jié)果同離體翻轉(zhuǎn)腸組。 3．口服吸收組均于給藥后30min出現(xiàn)峰值，對(duì)比Cmax，Control+OCT+SN組是Control+OCT組的3.6倍（P0.05）；BDL+OCT+SN組是BDL+OCT組的7.0倍（P0.05），是Control+OCT+SN組的1.6倍（P0.05），而Control+OCT組和BDL+OCT組無(wú)明顯差異（P0.05）。 對(duì)比AUC, Control+OCT+SN是Control+OCT組的4.8倍（P0.05）；BDL+OCT+SN組是BDL+OCT組的6.8倍（P0.05），是Control+OCT+SN組的1.4倍（P0.05），而Control+OCT組和BDL+OCT組的無(wú)明顯差異（P0.05）。 對(duì)比絕對(duì)生物利用度（absolute bioavailability, F），Control+OCT+SN組是Control+OCT組的3.79倍（P0.05）；BDL+OCT+SN組是BDL+OCT組的6.76倍（P0.05），是Control+OCT+SN組的1.6倍（P0.05），而Control+OCT組和BDL+OCT組的無(wú)明顯差異（P0.05）。 靜脈對(duì)照組大鼠均在給藥后10min出現(xiàn)峰值，Control+OCT組與BDL+OCT組的Cmax和AUC均無(wú)明顯差異（P0.05）。 結(jié)論：1.在大鼠離體與在體實(shí)驗(yàn)中，BDL大鼠與正常大鼠OCT腸吸收率及生物利用度無(wú)明顯差異。 2.在大鼠離體與在體實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論是BDL大鼠還是正常大鼠，SN均能提高OCT的腸吸收率及口服生物利用度，且在BDL大鼠中SN的促吸收作用更為顯著。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2227481