【摘要】：中國肝硬化人口十分龐大，而門脈高壓是肝硬化失代償期患者典型的臨床表現(xiàn)，又是肝硬化多種并發(fā)癥發(fā)生的根源及致死的主因。對門脈高壓進行積極有效防治是改善患者預后及降低病死率的關鍵，但目前尚無理想的口服藥物來預防門脈高壓。 奧曲肽（octreotide, OCT）是目前公認的治療肝硬化門脈高壓的有效藥物，雖可抵抗胃腸道中酸、酶的降解，但因分子量大，脂溶性差，受腸粘膜屏障和肝腸首過效應的影響，口服生物利用度極低，臨床上僅限于注射給藥，不利于作為預防性藥物長期應用。OCT口服可以避免長期反復注射給藥帶來的痛苦和不便，臨床意義重大。我們期待能像治療高血壓一樣，實現(xiàn)OCT口服，達到早期、持續(xù)服藥來防治門脈高壓。國內(nèi)外學者對此做了大量工作，但仍無任何一項研究成果可應用于臨床。 本課題組前期實驗建立了部分門脈結(jié)扎的門脈高壓大鼠模型，證實廣泛側(cè)支循環(huán)的建立可有效地降低OCT肝首過效應，故肝首過效應并非門脈高壓下OCT口服吸收的主要障礙。隨后，又進一步研究了肝硬化門脈高壓狀態(tài)時空腸首過效應中起著關鍵作用的轉(zhuǎn)運蛋白P-糖蛋白（p-glycoprotein, P-gp）、多耐藥相關蛋白2（multidrug resistance-associated protein2, MRP2）和代謝酶細胞色素P4503A4（cytochrome P4503A4, CYP3A4），探討了抑制腸上皮首過效應來增加OCT腸吸收的機制，故腸上皮首過效應問題也可得到解決。而對于OCT腸吸收至關重要的胞旁吸收途徑則是本次研究的重點。本研究通過對肝硬化門脈高壓大鼠空腸粘膜的形態(tài)學及分子水平的研究表明，門脈高壓狀態(tài)時空腸上皮緊密連接（tightjunction, TJ）蛋白Claudin-1表達減少，TJ松弛，腸粘膜屏障功能破壞，可使腸壁通透性增加，利于OCT的腸吸收。而通過Caco-2細胞模型證實促吸收劑青藤堿（sinomenine, SN）能夠通過激活蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）信號轉(zhuǎn)導通路來調(diào)控TJ蛋白Claudin-1的表達，實現(xiàn)短暫可逆的調(diào)節(jié)胞旁TJ，有效提高OCT在Caco-2細胞單層中的滲透率。預實驗初步證實SN能夠增加正常大鼠OCT的腸吸收率，本研究則進一步在肝硬化門脈高壓大鼠體內(nèi)及體外吸收模型上證實SN有效的提高了OCT口服生物利用度，且在肝硬化門脈高壓狀態(tài)時其促吸收效果更為顯著。 本研究旨在通過細胞及動物實驗，揭示SN可逆性調(diào)控胞旁TJ促進OCT腸吸收的機制，為提高OCT口服生物利用度提供有效可行的方法及途徑，為OCT臨床合理用藥提供理論依據(jù)，為實現(xiàn)口服OCT預防門脈高壓開創(chuàng)新紀元。 本研究共分三部分 第一部分青藤堿可逆調(diào)控腸上皮細胞緊密連接促奧曲肽吸收的機制研究 第二部分肝硬化門脈高壓對大鼠空腸上皮細胞緊密連接影響的研究 第三部分肝硬化門脈高壓時青藤堿促奧曲肽空腸吸收研究 第一部分 青藤堿可逆調(diào)控腸上皮細胞緊密連接促奧曲肽吸收的機制研究 目的：在Caco-2細胞單層模型上評估SN對OCT腸吸收的影響，明確SN可逆調(diào)控腸上皮細胞TJ的分子機制。 方法：1.建立Caco-2細胞單層模型，并通過形態(tài)學、跨膜電阻（transepithelialelectrical resistance, TEER）測量及胞旁漏出標記物異硫氰酸熒光素標記的右旋糖酐-4000（FD-4）的滲透量來考察Caco-2細胞單層的完整性。 2.通過乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）試驗考察不同濃度組（0.5%、1%、2%w/v) SN對Caco-2細胞單層的損傷情況。 3.通過TEER的測量及FD-4滲透量的計算明確SN對TJ的可逆性調(diào)節(jié)作用。 4. SN對OCT腸吸收的影響。分組：Control組（10μM OCT）；SN組（0.5%SN+10μM OCT）�？疾旄鹘MOCT的表觀滲透系數(shù)（apparent permeability coefficient,Papp）。 5. SN對TJ蛋白Claudin-1表達的影響。分組為：Control組；SN組（0.5%SN）、SN去除組（SN removal）及PKC抑制劑組(0.5%SN+10μM Ro318220)。運用蛋白免疫印跡（western blot）、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-Time-PolymeraseChain Reaction, Real-Time-PCR）、免疫熒光染色（Immunofluorescent Staining, IF）方法分別考察各組中Claudin-1的表達。 6. SN對PKC信號轉(zhuǎn)導通路的影響。分組：Control組，SN組（0.5%SN），運用western blot的方法分別考察PKC-α在對照組及SN組中細胞膜及胞漿中的表達。 結(jié)果：1.細胞培養(yǎng)21天后，倒置顯微鏡可見細胞之間的接觸；經(jīng)過測量和計 算，Caco-2細胞單層的TEER值均達到700Ω·cm2以上；1mg/ml的FD-4在120min 內(nèi)的滲透量（AP-BL側(cè)）無明顯變化，一直處于較低水平（0.5pmol/cm2），說明細胞間已形成完整的TJ。 2. LDH試驗顯示120min后，中濃度組（1%）及高濃度組（2%）的SN對細胞均有損傷，與對照組相比P0.05；而低濃度組（0.5%）SN對細胞無明顯損傷，與對照組相比P0.05。 3.0.5%SN作用120min時，TEER%降至最低點，為起始TEER值的43%，F(xiàn)D-4的流出量達到最高，與對照組相比，P0.05；去除SN的作用后，TEER%又迅速回升，在SN去除120min（總時間的240min）時恢復到起始水平，與對照組相比，P0.05。 4.共同給予0.5%SN和10μM OCT120min時，OCT的Papp為5.89±0.038×106cm/s，是對照組（單給10μM OCT）的2.2倍（P0.05）。 5. IF顯示Control組中Claudin-1蛋白均勻表達于細胞膜，顯示較強的綠色熒光；0.5%SN作用120min后，綠色熒光強度明顯減弱，細胞間的連接出現(xiàn)斷斷續(xù)續(xù)的改變；去除SN120min時，細胞膜上的綠色熒光再次增強，細胞間的TJ完整性又恢復；而在SN+Ro318220共同作用120min時，細胞膜上的綠色熒光強度及細胞間TJ形態(tài)較給藥前無明顯變化。Western blot及Real-Time-PCR結(jié)果顯示，0.5%SN組較Control組Claudin-1蛋白表達明顯降低（P0.05），SN removal組及0.5%SN+10μM Ro318220組Claudin-1蛋白表達均較Control組無明顯差異（P0.05）。 6.對照組中，PKC-α蛋白主要在細胞質(zhì)內(nèi)表達，細胞膜上表達量很少；而0.5%SN組，PKC-α則從細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移出來，主要表達于細胞膜上，表達量與Control組相比具有統(tǒng)計學意義(P0.05)，這種PKC-α的轉(zhuǎn)膜現(xiàn)象意味著PKC通路的激活。 結(jié)論：1.在Caco-2單層細胞模型上，SN能夠促進OCT的吸收。 2. TJ蛋白Claudin-1在SN可逆性調(diào)控TJ中發(fā)揮著重要作用，且很可能與PKC信號轉(zhuǎn)導通路的激活有關。 第二部分 肝硬化門脈高壓對大鼠空腸上皮細胞緊密連接影響的研究 目的：在肝硬化門脈高壓大鼠模型上，從形態(tài)學及分子水平對OCT胞旁吸收途徑的主要結(jié)構(gòu)—TJ進行研究，探討肝硬化門脈高壓對腸粘膜屏障的影響及機制。 方法：大鼠肝硬化門脈高壓模型采用膽總管結(jié)扎（bile duct ligation, BDL）方法來制備。將健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機分為2組，即Control和BDL組。BDL術(shù)后4周，對2組大鼠進行門靜脈壓力測定，之后處死大鼠，取血、取肝、取空腸，采用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)水平；HE染色觀察肝臟病理形態(tài)學；透射電鏡（transmission electron microscope,TEM）觀察空腸上皮細胞間TJ形態(tài)；免疫組織化學染色（ImmunohistochemistryStaining, IHC）、western blot及Real-Time-PCR方法觀察大鼠空腸Claudin-1蛋白及基因表達情況。 結(jié)果：1.大鼠門脈壓力比較，BDL組較Control組明顯升高（P0.01）；對比ALT和AST值，BDL組較Control組明顯升高(P0.01)。 2.大鼠肝臟HE染色結(jié)果顯示BDL組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，大量纖維組織增生，炎性細胞侵潤，見多個假小葉，，小葉間膽管增生明顯。 3．TEM觀察顯示BDL大鼠空腸上皮細胞間TJ松弛，細胞間隙增寬。 4. IHC及western blot結(jié)果顯示BDL組Claudin-1蛋白表達較Control組降低（P0.01）；Real-Time-PCR方法顯示BDL組Claudin-1基因表達較Control組降低（P0.01）。 結(jié)論：肝硬化門脈高壓大鼠空腸粘膜超微結(jié)構(gòu)改變，TJ蛋白Claudin-1表達減少，TJ松弛，為增加OCT的胞旁滲透提供了可能。 第三部分肝硬化門脈高壓時青藤堿促奧曲肽空腸吸收研究 目的：通過肝硬化門脈高壓大鼠離體翻轉(zhuǎn)腸、腸灌流及灌胃給藥等多種藥物吸收模型，明確SN在門脈高壓狀態(tài)時對OCT腸吸收的促進作用。 方法：1.建立BDL大鼠模型，運用離體翻轉(zhuǎn)腸實驗，考察SN對漿膜側(cè)OCT濃度影響。實驗大鼠隨機分組及給藥濃度如下（n=4）：Control+OCT組：單給10μMOCT；Control+OCT+SN組：給予10μM OCT+0.5%SN；BDL+OCT組：單給10μMOCT；BDL+OCT+SN組：給予10μM OCT+0.5%SN。 2.運用大鼠在體空腸灌流實驗，考察SN對血中OCT濃度影響。分組及給藥濃度同翻轉(zhuǎn)腸實驗。 3.通過大鼠灌胃實驗，考察SN對OCT生物利用度的影響。實驗大鼠隨機分組及給藥濃度如下（n=4）：Control+OCT靜脈給藥組：每只大鼠單給OCT20μg；Control+OCT口服給藥組：每只大鼠單給OCT200μg；Control+OCT+SN口服給藥組：每只大鼠給予OCT200μg+SN30mg；BDL+OCT靜脈給藥組：每只大鼠單給OCT20μg；BDL+OCT口服給藥組：每只大鼠單給OCT200μg；BDL+OCT+SN口服給藥組：每只大鼠給予OCT200μg+SN30mg。 結(jié)果：1.離體翻轉(zhuǎn)腸實驗，對比OCT濃度，BDL+OCT+SN組較BDL+OCT組明顯升高(P0.05)；Control+OCT+SN組較Control+OCT組明顯升高(P0.05)；BDL+OCT+SN組較Control+OCT+SN組也有所升高(P0.05)； BDL+OCT組與Control+OCT組無明顯差異(P0.05)。 2.體空腸灌流實驗，對比OCT濃度，結(jié)果同離體翻轉(zhuǎn)腸組。 3．口服吸收組均于給藥后30min出現(xiàn)峰值，對比Cmax，Control+OCT+SN組是Control+OCT組的3.6倍（P0.05）；BDL+OCT+SN組是BDL+OCT組的7.0倍（P0.05），是Control+OCT+SN組的1.6倍（P0.05），而Control+OCT組和BDL+OCT組無明顯差異（P0.05）。 對比AUC, Control+OCT+SN是Control+OCT組的4.8倍（P0.05）；BDL+OCT+SN組是BDL+OCT組的6.8倍（P0.05），是Control+OCT+SN組的1.4倍（P0.05），而Control+OCT組和BDL+OCT組的無明顯差異（P0.05）。 對比絕對生物利用度（absolute bioavailability, F），Control+OCT+SN組是Control+OCT組的3.79倍（P0.05）；BDL+OCT+SN組是BDL+OCT組的6.76倍（P0.05），是Control+OCT+SN組的1.6倍（P0.05），而Control+OCT組和BDL+OCT組的無明顯差異（P0.05）。 靜脈對照組大鼠均在給藥后10min出現(xiàn)峰值，Control+OCT組與BDL+OCT組的Cmax和AUC均無明顯差異（P0.05）。 結(jié)論：1.在大鼠離體與在體實驗中，BDL大鼠與正常大鼠OCT腸吸收率及生物利用度無明顯差異。 2.在大鼠離體與在體實驗中，無論是BDL大鼠還是正常大鼠，SN均能提高OCT的腸吸收率及口服生物利用度，且在BDL大鼠中SN的促吸收作用更為顯著。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前8條

1 金城,王海濤,肖小河;蛋白多肽類藥物口服給藥的研究進展[J];解放軍藥學學報;2005年01期

2 馬驍;劉冰熔;;門靜脈高壓藥物治療的新進展[J];世界華人消化雜志;2008年33期

3 韋志坤;程愛國;;腸黏膜細胞的緊密連接與腸壁通透性的研究進展[J];世界華人消化雜志;2011年04期

4 Soong Lee;Seung-Cheol Son;Moon-Jong Han;Woo-Jin Kim;Soo-Hyun Kim;Hye-Ran Kim;Woo-Kyu Jeon;Ki-Hong Park;Myung-Geun Shin;;Increased intestinal macromolecular permeability and urine nitrite excretion associated with liver cirrhosis with ascites[J];World Journal of Gastroenterology;2008年24期

5 段志軍;李吉彥;譚晨;周仕壯;王冬梅;馬曉凱;楊洪濤;白長川;胡祥;;益氣軟肝方與肝刺激因子對大鼠免疫性肝纖維化保護作用的對照研究[J];中醫(yī)雜志;2003年05期

6 王婷;;蛋白多肽類口服給藥微粒載體研究進展[J];藥物生物技術(shù);2012年04期

7 Qiu-Ming Wang;Jian-Ling Du;Zhi-Jun Duan;Shi-Bin Guo;Xiao-Yu Sun;Zhen Liu;;Inhibiting heme oxygenase-1 attenuates rat liver fibrosis by removing iron accumulation[J];World Journal of Gastroenterology;2013年19期

8 李晗;梅興國;;多囊脂質(zhì)體遞送蛋白質(zhì)/多肽類藥物的研究進展[J];中國藥學雜志;2014年02期

本文編號：2227481