本文選題：腸易激綜合征 + 促腎上腺素皮質(zhì)激素釋放因子　； 參考：《鄭州大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是消化內(nèi)科最常見的慢性復(fù)發(fā)性胃腸道疾病,以羅馬III標(biāo)準(zhǔn)為診斷標(biāo)準(zhǔn),IBS的全球發(fā)病率為1.1%到29.2%[1]。IBS的主要特征是腹痛、腹部不適,伴有排便習(xí)慣的改變。患者癥狀遷延起伏,生活質(zhì)量顯著下降,使得IBS成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。它的發(fā)病機制不完全明確,有多個系統(tǒng)參與其中,比如腦-腸軸調(diào)節(jié)異常、腸道屏障功能障礙、內(nèi)臟高敏感性、腸道運動功能異常等,而心理應(yīng)激、食物不耐受、腸道感染是重要的誘發(fā)因素[2]。有部分IBS患者的癥狀是由焦慮、緊張、憤怒、恐懼等心理應(yīng)激(stress)所誘發(fā)[3]。應(yīng)激作為對機體內(nèi)部穩(wěn)態(tài)的一種威脅,能夠?qū)е履X-腸軸調(diào)節(jié)功能異常,進(jìn)而引起一系列廣泛的胃腸道效應(yīng),最終導(dǎo)致IBS的發(fā)生。應(yīng)激反應(yīng)中所釋放的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotropin releasing factor,CRF)是重要的調(diào)節(jié)介質(zhì),它是一種41氨基酸肽,可由中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織產(chǎn)生。人體的胃腸道中普遍有CRF的表達(dá),與中樞CRF的作用方式不同,腸道中神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和免疫細(xì)胞釋放的外周CRF可直接激活免疫細(xì)胞,在局部發(fā)揮促炎作用或作用于內(nèi)臟神經(jīng)末梢[4]。CRF的活性是通過與效應(yīng)細(xì)胞上CRF受體CRF-R1或/和CRF-R2受的結(jié)合來介導(dǎo)的,它們是特殊的七次穿膜的G蛋白偶聯(lián)受體[5,6],應(yīng)激反應(yīng)可以導(dǎo)致其在腸道的表達(dá)異常[7]。研究發(fā)現(xiàn),IBS患者腸道組織中,有CRF上調(diào)的現(xiàn)象[8];而避水應(yīng)激、束縛應(yīng)激均可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)腸道運動異常和內(nèi)臟高敏感性,結(jié)腸組織中也存在外周CRF升高的現(xiàn)象[9,10]。所以CRF是導(dǎo)致IBS的發(fā)生的關(guān)鍵效應(yīng)因子。近年來,肥大細(xì)胞在IBS發(fā)病機制中的作用逐漸受到研究者們的關(guān)注[11]。在IBS患者的腸道的各部位均可以觀察到肥大細(xì)胞的增殖[12-15]。肥大細(xì)胞屬于腸道固有免疫系統(tǒng),與腸道的主要功能關(guān)系密切,可以調(diào)節(jié)腸道屏障功能、上皮細(xì)胞的分泌功能、腸道的血供、神經(jīng)-免疫系統(tǒng)的相互作用、內(nèi)臟的敏感性以及腸道的運動功能等[15]。若腸道中的肥大細(xì)胞發(fā)生增殖和活化,其釋放的各種細(xì)胞因子、趨化物質(zhì)和蛋白酶,可激活神經(jīng)-免疫系統(tǒng),導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感性、腸道運動功能的異常、腸道屏障功能的異常以及內(nèi)分泌功能的異常,最終可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)腹痛、腹脹、腹瀉或/和便秘等IBS的癥狀[17]。腸道有大量的共生菌群(commensal microfla),也稱為原籍菌,定植于腸上皮細(xì)胞的表面,一些細(xì)菌的成分比如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖、細(xì)菌產(chǎn)生的超抗原、細(xì)菌的Cp G-DNA序列、熱休克蛋白等都有激活免疫細(xì)胞的作用[17]。為了維持免疫穩(wěn)態(tài),生理狀態(tài)下,作為暴露于腸內(nèi)細(xì)菌的第一線,腸道上皮細(xì)胞及腸道免疫細(xì)胞對共生菌群均處于一種免疫耐受的狀態(tài)。其中,對LPS產(chǎn)生的耐受被稱為內(nèi)毒素耐受(endotoxin tolerance,ET)。在這個調(diào)控機制中,模式識別受體Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)發(fā)揮了重要的作用。其中,TLR4是LPS的受體,研究表明,結(jié)腸上皮細(xì)胞、腸道巨噬細(xì)胞的內(nèi)毒素耐受可能是通過下調(diào)TLR4的表達(dá)來實現(xiàn)的[18-20]。細(xì)胞因子信號抑制蛋白(suppressors of cytokine signaling,SOCS)家族在維持內(nèi)毒素耐受的過程中也發(fā)揮了重要的作用[21]。肥大細(xì)胞作為腦-腸軸的重要的效應(yīng)細(xì)胞在消化道黏膜廣泛分布,同時又處于與共生菌群接觸的第一線,其TLRs信號途徑經(jīng)過精心調(diào)控,維持著內(nèi)毒素耐受。那么,當(dāng)肥大細(xì)胞的內(nèi)毒素耐受被打破,原本對LPS的低反應(yīng)狀態(tài)發(fā)生改變,必將激活下游的效應(yīng)系統(tǒng),引起腸道免疫系統(tǒng)的激活,導(dǎo)致內(nèi)臟高反應(yīng)、腸道屏障功能障礙及腸道運動的異常。我們團隊的研究顯示,CRF可調(diào)控上皮細(xì)胞上TLR4的表達(dá),從而打破其對LPS的耐受[22]。肥大細(xì)胞表達(dá)有CRF的受體CRF-R1和CRF-R2,同時還表達(dá)TLR4,那么CRF是否能夠打破肥大細(xì)胞細(xì)胞的內(nèi)毒素耐受是一個值得探討的問題。腸道屏障主要由微生物屏障、粘液層、腸道上皮細(xì)胞層、黏膜下層的淋巴細(xì)胞和固有免疫細(xì)胞等構(gòu)成,發(fā)揮著雙重的作用:一方面要從腸道的食物中吸收營養(yǎng);一方面要選擇性的控制腸腔內(nèi)的食物抗原、腸道原籍菌及其活性成分進(jìn)入腸道固有免疫系統(tǒng)、產(chǎn)生免疫反應(yīng)。所以,腸道屏障功能在維持腸道正常生理功能和免疫穩(wěn)態(tài)中具有至關(guān)重要的作用。腸道屏障功能障礙是指腸黏膜的通透性發(fā)生持續(xù)的升高,導(dǎo)致腸道免疫穩(wěn)態(tài)失衡、功能受損和疾病發(fā)生[23]。許多IBS的患者中存在著腸黏膜通透性增高的情況,這可能會導(dǎo)致腸道內(nèi)共生菌的某些成分和大分子食物抗原進(jìn)入并激活腸道免疫系統(tǒng),導(dǎo)致各種活性物質(zhì)的釋放,患者出現(xiàn)IBS的癥狀[24,25]。雖然目前導(dǎo)致IBS患者腸道屏障功能障礙的機制并不明確,但很多研究者認(rèn)為這種現(xiàn)象與腸道的低度炎癥有關(guān),是由促炎因子的持續(xù)作用所導(dǎo)致,而腸道的低度炎癥又與活化的肥大細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)[26,27]。激活的肥大細(xì)胞所釋放的的肥大細(xì)胞蛋白酶(mast cell protease,MCP)類物質(zhì)和TNF-α能夠?qū)е履c黏膜通透性增高[28]。但若肥大細(xì)胞對LPS的內(nèi)毒素耐受能夠被打破,LPS-TLR4途徑的細(xì)胞因子是否能夠影響腸道屏障功能尚需探討。綜上所述,應(yīng)激反應(yīng)中釋放的CRF是IBS病理生理過程中最重要的效應(yīng)因子,肥大細(xì)胞是腸黏膜免疫系統(tǒng)中重要的固有免疫細(xì)胞,腸道屏障功能障礙是IBS發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。正常生理條件下,肥大細(xì)胞保持著對LPS的內(nèi)毒素耐受。那么,CRF是否能夠調(diào)控肥大細(xì)胞打破其對LPS的內(nèi)毒素耐受,進(jìn)而引起腸道屏障功能障礙,通過什么機制導(dǎo)致腸道屏障功能障礙,是本研究旨在探討的問題。希望通過本研究能夠進(jìn)一步闡明IBS的發(fā)病機制,為IBS的治療尋找新的證據(jù),探索新的前景。第一部分CRF調(diào)控肥大細(xì)胞打破內(nèi)毒素耐受的機制研究目的:肥大細(xì)胞表達(dá)有CRF的受體CRF-R1和CRF-R2,CRF可以通過與二者結(jié)合誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒,釋放出MCP和TNF-α。但CRF是否能夠通過調(diào)控肥大細(xì)胞表面的TLR4受體、以及SOCS系統(tǒng)來打破肥大細(xì)胞對LPS的內(nèi)毒素耐受,最終合成釋放LPS-TLR4途徑的細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、IL-13和TNF-α),目前尚不明確。本研究在體外用LPS誘導(dǎo)HMC-1肥大細(xì)胞建立內(nèi)毒素耐受,再用CRF對內(nèi)毒素耐受的肥大細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),了解CRF是否能夠調(diào)控肥大打破其對LPS的內(nèi)毒素耐受,并闡明其相關(guān)機制。材料與方法:1.用不同濃度的LPS(0、10、100ng/mL)預(yù)處理HMC-1肥大細(xì)胞,再以100ng/m L的LPS進(jìn)行激發(fā),透射電鏡觀察各組細(xì)胞脫顆粒的情況,ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、MCP,IL-1β、IL-6以及IL-13的水平。2.在成功誘導(dǎo)針對LPS內(nèi)毒素耐受的基礎(chǔ)上,用不同劑量的CRF(0,50,100 pg/m L)作用于耐受的肥大細(xì)胞,觀察其對肥大細(xì)胞表面TLR2、TLR4 m RNA和蛋白表達(dá)的影響。為了了解這種調(diào)控作用是通過CRF與CRF-R1或/和CRF-R2結(jié)合,在細(xì)胞內(nèi)是以Erk1/2還是以p38 MAPK信號途徑轉(zhuǎn)導(dǎo),分別以不同的拮抗劑在CRF干預(yù)前進(jìn)行預(yù)處理。收集各組細(xì)胞,提取總m RNA和總蛋白,進(jìn)行Realtime-PCR和Western blotting的檢測。3.為了解TLR4是否CRF打破肥大細(xì)胞內(nèi)毒素耐受的中心環(huán)節(jié),設(shè)計合成sh RNA,構(gòu)建慢病毒載體對HMC-1肥大細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,對HMC-1肥大細(xì)胞的TLR4基因進(jìn)行基因沉默。4.將按步驟2中處理的各組細(xì)胞及TLR4 null的細(xì)胞,予以100ng/mL的LPS激發(fā),透射電鏡觀察各組細(xì)胞脫顆粒的情況,ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、MCP,IL-1β、IL-6以及IL-13的水平,以了解各組細(xì)胞的內(nèi)毒素耐受是否被打破。5.在成功誘導(dǎo)針對LPS內(nèi)毒素耐受的基礎(chǔ)上,分別以(0,100pg/ml)濃度的CRF處理內(nèi)毒素耐受的肥大細(xì)胞,并設(shè)置以CRF拮抗劑預(yù)處理的CRF-anta組,后予以LPS激發(fā),收集細(xì)胞進(jìn)行Realtime-PCR和Western blotting的檢測SCOS-1和SCOS-3 m RNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果1.在體外以100ng/m L濃度的LPS預(yù)處理的HMC-1肥大細(xì)胞,再次以100ng/m L的LPS激發(fā)后,較未誘導(dǎo)耐受的naive細(xì)胞相比,其釋放的TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-13的水平顯著下降(P0.05),MCP的水平則無顯著差異(P0.05)。各組細(xì)胞均未發(fā)生脫顆�，F(xiàn)象。提示內(nèi)毒素耐受成功建立。2.以不同濃度的CRF處理內(nèi)毒素耐受的HMC-1肥大細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)相對于對照組,100pg/ml的CRF可以顯著上調(diào)肥大細(xì)胞表面的TLR4 m RNA和蛋白的表達(dá)(P0.05),這個作用可以被CRF-R1和Erk1/2的拮抗劑所解除。各組細(xì)胞間TLR2m RNA和蛋白的表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3.設(shè)計合成sh RNA,構(gòu)建慢病毒載體對HMC-1肥大細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,對TLR4基因進(jìn)行基因沉默,成功構(gòu)建了TLR4 null的肥大細(xì)胞。4.按步驟2中處理的各組細(xì)胞及TLR4 null的細(xì)胞,予以LPS激發(fā),發(fā)現(xiàn)100pg/ml的CRF有雙重作用:它可以引起HMC-1肥大細(xì)胞發(fā)生脫顆粒反應(yīng),釋放MCP和TNF-α;同時,它可以打破肥大細(xì)胞的內(nèi)毒素耐受,釋放IL-1β、IL-6、IL-13和TNF-α。CRF誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒的作用可以被CRF-R1和CRF-R2拮抗劑所解除;而CRF打破內(nèi)毒素耐受的作用,可以被CRF-R1和Erk1/2的拮抗劑所解除。TLR4 null的細(xì)胞,既不能建立對LPS內(nèi)毒素耐受,也不能被CRF誘導(dǎo)打破耐受。5.對內(nèi)毒素耐受的肥大細(xì)胞予以100pg/ml的CRF處理,相對于對照組,其信號抑制蛋白SCOS-1和SCOS-3 m RNA和蛋白的表達(dá)顯著下降(P0.05),這種作用可以被CRF受體拮抗劑所阻斷。結(jié)論:CRF可以通過兩種途徑激活肥大細(xì)胞:一是與肥大細(xì)胞上的CRF-R1和CRF-R2結(jié)合,直接引起肥大細(xì)胞脫顆粒,導(dǎo)致MCP和TNF-α釋放。二是與肥大細(xì)胞上的CRF-R1結(jié)合,通過細(xì)胞內(nèi)的Erk1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,上調(diào)肥大細(xì)胞表面TLR4的表達(dá);同時,下調(diào)了對LPS-TLR4-NFκB通路有抑制作用的細(xì)胞因子信號抑制蛋白SCOS-1和SCOS-3的表達(dá),最終導(dǎo)致肥大細(xì)胞對LPS的內(nèi)毒素耐受被打破,LPS-TLR4途徑的細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-13和TNF-α釋放。第二部分CRF調(diào)控肥大細(xì)胞導(dǎo)致腸道屏障功能障礙的機制研究目的:腸道屏障功能障礙會導(dǎo)致腸黏膜通透性增高,腸道內(nèi)共生菌的某些成分和大分子食物抗原進(jìn)入并激活腸道免疫系統(tǒng),導(dǎo)致患者出現(xiàn)IBS的癥狀。上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白和細(xì)胞膜上表達(dá)的某些離子通道蛋白(比如TWIK-related potassium channel-1,Trek1)對于維持腸道屏障功能有重要作用。目前,CRF激活肥大細(xì)胞引起腸道屏障功能障礙的機制不完全明確,尤其是CRF調(diào)控肥大細(xì)胞打破內(nèi)毒素耐受后,LPS-TLR4途徑所釋放的細(xì)胞因子引起腸道屏障功能障礙的機制尚不清楚,是本研究旨在解決的問題。材料與方法1.6-8周齡Balb/c小鼠40只,分為對照組(Control組)、避水應(yīng)激組(Stress組)、假避水組(Sham組)、CRF拮抗劑(CRF-anta組)、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑(MC stabilizer組),分別給予不同的干預(yù)后,按照避水程序進(jìn)行避水。Control組不避水,Sham組水槽中不加水。第10天避水結(jié)束后處死小鼠,取血清及結(jié)腸組織。新鮮組織進(jìn)行尤斯室實驗;另取組織用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋、切片,行HE染色和免疫熒光檢測;留取組織凍存于-80℃低溫冰箱,待行Real time-PCR和Western blotting檢測。2.ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-13、TNF-α和MCP的水平。3.將新鮮結(jié)腸組織剝離漿膜層和肌層,放入尤斯室后平衡30分鐘,待短路電流(Isc)穩(wěn)定后,使用數(shù)據(jù)采集軟件,每30分鐘在尤斯室中記錄跨膜電導(dǎo)G、短路電流Isc,共2小時。以HRP(44k D)作為蛋白探針模型用于檢測黏膜對大分子物質(zhì)的通透性變化,以HRP回收率(HRP%)表示黏膜對HRP的通透性。4.分別提取結(jié)腸組織的總RNA和總蛋白,Realtime-PCR和Western blotting法檢測claudin5,7,8,12,15和Trek1 m RNA和蛋白的表達(dá)。5.免疫熒光法檢測Trek1蛋白在結(jié)腸組織中的表達(dá)。6.將人結(jié)腸上皮細(xì)胞系T84細(xì)胞接種于Transwell系統(tǒng)內(nèi),制備單層細(xì)胞層,分別加入CRF激活肥大細(xì)胞后釋放的細(xì)胞因子IL-1β,IL-6,IL-13,MCP或TNF-α,觀察它們對T84上皮細(xì)胞層Trek1 m RNA和蛋白的影響。結(jié)果:1.ELISA法對各處理組小鼠血清中的MCP、TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-13水平進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)Stress組小鼠血清中5種細(xì)胞因子的水平顯著高于其它4組(P0.05),其它4組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2.尤斯室中測得Stress組小鼠的G、Isc以及HRP回收率均顯著高于Control組和Sham組(P0.05);而CRF-anta組和MC stabilizer組G、Isc以及HRP回收率均顯著低于Stress組(P0.05),與Control組和Sham組相比則無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。提示在應(yīng)激反應(yīng)下,小鼠結(jié)腸黏膜的通透性增高,但這種作用可以被CRF受體拮抗劑和肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑所拮抗。3.結(jié)腸組織的HE染色提示相較于對照組和假避水組,Stress組結(jié)腸上皮細(xì)胞排列紊亂,上皮細(xì)胞間的間隙變大。而CRF拮抗劑和肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組小鼠的結(jié)腸HE染色與對照組和假避水組相比,結(jié)構(gòu)相似,無明顯的差異。4.對各組小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行Trek1和Claudin5,7,8,12,15m RNA和蛋白檢測,結(jié)果顯示各組間Claudin5,7,8,12,15m RNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而Trek1 m RNA和蛋白的表達(dá)水平在各組間有差異,Stress組的Trek1 m RNA和蛋白顯著低于其他4組(P0.05),提示應(yīng)激小鼠結(jié)腸組織中Trek1 m RNA和蛋白顯著降低,但經(jīng)過CRF受體拮抗劑和肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑干預(yù)后,Trek1 m RNA和蛋白的水平可恢復(fù)。5.用免疫熒光法檢測各組小鼠結(jié)腸組織中的Trek1蛋白的表達(dá)(用FITC標(biāo)記的綠色熒光表示),與m RNA和蛋白的檢測結(jié)果一致,Stress組小鼠結(jié)腸的Trek1蛋白的熒光強度顯著低于其他4組。6.IL-1β,IL-6,IL-13,MCP或TNF-α干預(yù)T84上皮細(xì)胞層后,Trek1 m RNA和蛋白的表達(dá)均顯著低于對照組(P0.05)。由于這幾種細(xì)胞因子都可以激活P38MAPK途徑,我們重復(fù)了上述實驗過程,在培養(yǎng)液中預(yù)先加入了p38抑制劑,發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了這幾種細(xì)胞因子對Trek1 m RNA和蛋白的抑制作用被解除。結(jié)論:CRF可調(diào)控肥大細(xì)胞導(dǎo)致避水應(yīng)激的小鼠腸黏膜透性增高,這種作用是通過CRF激活肥大細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子IL-1β,IL-6,IL-13,MCP和TNF-α通過p38MAPK途徑抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞中Trek1的表達(dá)實現(xiàn)的。第三部分雙孔鉀離子通道蛋白Trek1對腸道屏障功能的調(diào)節(jié)作用目的:腸道屏障功對于維持全身的免疫穩(wěn)態(tài)有著重要的意義。然而,導(dǎo)致IBS患者腸道屏障功能障礙的機制并不完全明確,改善腸道屏障功能的治療方法也很有限。雙孔鉀離子通道Trek1蛋白定位于上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞,在肺泡上皮細(xì)胞、心血管內(nèi)皮細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞均有表達(dá)。近期研究表明Trek1能夠調(diào)整肺泡上皮屏障功能、血腦屏障功能、神經(jīng)-免疫細(xì)胞屏障功能。在第二部分研究中,我們發(fā)現(xiàn)Trek1的表達(dá)下調(diào)的結(jié)腸黏膜的通透性增加,推測Trek1的表達(dá)可以調(diào)節(jié)腸道屏障功能。在本研究中,將進(jìn)一步探討Trek1與腸道屏障功能的關(guān)系。材料與方法:1.體外培養(yǎng)腸上皮系T84細(xì)胞,待細(xì)胞生長狀況良好將其以106 cells/ml的濃度將三組細(xì)胞接種于的Millpore Transwell系統(tǒng)的insert(無包被,濾孔直徑為0.4μm)中制作單細(xì)胞層。每日用Millicell-ERS的歐姆儀檢測T84單層的跨膜電阻TER,當(dāng)TER大于1000?/cm~2時,開始進(jìn)行后續(xù)的實驗。2.使用sh RNA法,對T84細(xì)胞進(jìn)行基因沉默。設(shè)空載質(zhì)粒對照組csh RNA和PBS處理的Medium組。3.使用Millicell-ERS歐姆儀分別于0h、8h、16h、2d、3d、4d、5d、6d、7d這9個時間點記錄各組單細(xì)胞層的TER值。4.將HRP以10-5mol/L的濃度加入上室,30分鐘后分別收集上室和下室的細(xì)胞培養(yǎng)液,檢測HRP酶的活性。對HRP的通透性以HRP回收率(HRP%)表示。5.在基因沉默的T84單層細(xì)胞中按照0,10,100,1000nmol/L的濃度梯度加入重組蛋白r Trek1。設(shè)立以無關(guān)蛋白BSA處理的陰性對照和無任何處理的wild組作為陽性對照。分別檢測各組單層細(xì)胞的跨膜電阻TER和HRP%。結(jié)果:1.對T84細(xì)胞分別進(jìn)行shRNA、陰性對照(cshRNA)以及中性緩沖液PBS(medium)處理,Western blotting的結(jié)果提示在進(jìn)行sh RNA轉(zhuǎn)染處理的0-7天中,T84單層細(xì)胞中Trek1蛋白的表達(dá)從第1d開始下降,到第2d顯著下降,始終維持在很低的水平,一直到7d,提示我們sh RNA操作是成功的�；叶确治鲲@示sh RNA組中Trek1蛋白的表達(dá)水平(β-actin%)顯著低于csh RNA及medium組(P0.05)。2.對T84細(xì)胞的Trek1基因進(jìn)行沉默后,T84單層上皮細(xì)胞層的TER從第16h開始下降,到第48h顯著下降,并且一直維持較低的水平至第7天,從第16h到第7d,sh RNA組中T84單層細(xì)胞跨膜電阻TER始終顯著低于csh RNA及medium組(P0.05)。3.在對T84細(xì)胞的Trek1基因進(jìn)行沉默后,HRP%從第16h開始升高,到第48h顯著升高,并且一直維持較高的水平至第7天,從第16h到第7d,sh RNA組中T84單層細(xì)胞對HRP的回收率HRP%始終顯著高于csh RNA及medium組(P0.05)。4.經(jīng)100n M、1000n M r Trek1處理的Trek1 null T84細(xì)胞,其單層細(xì)胞跨膜電阻TER均顯著高于0n M,10n M r Trek1處理組和BSA處理組(P0.05),提示再加入重組的r Trek1后,基因沉默引起的T84單層細(xì)胞跨膜電阻TER恢復(fù)正常。5.經(jīng)100nM、1000n M r Trek1處理的Trek1 null T84細(xì)胞,其單層細(xì)胞對HRP通透性(HRP%)均顯著低于0n M,10n M r Trek1處理組和BSA處理組(P0.05),提示再加入重組的r Trek1后,基因沉默引起的T84單層細(xì)胞對HRP通透性升高的現(xiàn)象顯著改善。結(jié)論:結(jié)腸上皮細(xì)胞表達(dá)Trek1,體外將T84細(xì)胞的Trek1基因進(jìn)行沉默可導(dǎo)致腸上皮屏障的通透性增高,再加入重組的r Trek1蛋白則可恢復(fù)腸上皮屏障功能。提示Trek1對維持正常的腸道屏障功能有重要的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R574.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Rosa LS Soares;;Irritable bowel syndrome:A clinical review[J];World Journal of Gastroenterology;2014年34期

2 劉思o(jì)，

本文編號：2088463