發(fā)布時(shí)間：2018-06-28 07:26

  本文選題：長鏈非編碼RNA + 基因芯片　； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的近年來,長鏈非編碼RNAs(Long non-coding RNAs,lnc RNAs)的研究成為熱點(diǎn)。已證實(shí),lnc RNAs通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)參與多種生物進(jìn)程。但肝纖維化發(fā)病過程中l(wèi)nc RNAs的作用尚不清楚。本研究利用基因芯片分析技術(shù)分析肝纖維化模型小鼠CCl4組和正常組中l(wèi)nc RNAs的表達(dá)差異,篩選出顯著差異表達(dá)的lnc RNAs,并對其功能進(jìn)行初步的研究,明確了lnc RNAs在肝纖維化發(fā)病及發(fā)展過程中的作用。方法1.四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)建立小鼠肝纖維化模型:將20只SPF級雄性、8周大的balb/c小鼠隨機(jī)平均分成兩組,一組為實(shí)驗(yàn)組,連續(xù)腹腔注射CCl4六周;一組為對照組,腹腔注射橄欖油;每周2次,六周后取材。2.取兩組小鼠肝組織進(jìn)行Haematoxylin-eosin staining(HE染色)、天狼猩紅染色、免疫組織化學(xué)染色(α-SMA和Col1α1),觀察其病理學(xué)改變。3.羥脯氨酸試劑盒測定實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠組織中羥脯氨酸的含量。4.q RT-PCR和免疫熒光檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠肝組織中α-SMA和Col1α1的表達(dá)量。通過以上試驗(yàn)證明肝纖維化小鼠模型建立成功。5.各選取5只正常組和肝纖維化組小鼠的肝組織送質(zhì)檢,質(zhì)檢合格后用于芯片分析。6.對芯片結(jié)果進(jìn)行分析,篩選出差異表達(dá)的lnc RNAs和m RNAs。7.根據(jù)差異分析、GO分析、pathway分析、和lnc RNA-m RNA共表達(dá)分析、臨近基因分析、micro-RNA結(jié)合位點(diǎn)分析等篩選lnc RNAs。8.建立肝纖維化小鼠CCl4模型(balb/c和C57),并對芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。9.q RT-PCR檢測同一lnc RNA在不同細(xì)胞(HSC、HC和kuffer)和不同器官中的表達(dá)情況。10.Coding Potential Calculator(CPC)軟件分析篩選出的lnc RNAs蛋白編碼能力。11.構(gòu)建包含有l(wèi)nc RNAs ORF區(qū)域,且?guī)в袩晒獾鞍妆磉_(dá)基因的質(zhì)粒,檢測是否有熒光的表達(dá),從而確定lnc RNAs是否具有蛋白編碼功能。12.利用c DNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of c DNA ends,RACE)擴(kuò)增c DNA的5'和3'末端并測序。13.核漿分離檢測lnc RNAs在胞漿和胞核中的分布情況。14.q RT-PCR檢測lnc RNAs在纖維化小鼠的原代HSCs、HCs以及正常小鼠原代HSCs培養(yǎng)激活過程中的表達(dá)。15.TGF-β刺激小鼠原代肝星形細(xì)胞、原代肝細(xì)胞和小鼠正常肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞,檢測lnc RNAs的表達(dá)變化。16.檢測肝纖維化病人組織和血液中l(wèi)nc RNA的表達(dá)情況。17.對篩選出的lnc RNA分別進(jìn)行敲除和過表達(dá),檢測肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果1.對照組小鼠肝臟標(biāo)本質(zhì)地柔軟、紅潤有光澤、體積較小;與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟標(biāo)本則質(zhì)地變硬、色澤度下降、表面出現(xiàn)結(jié)節(jié)、體積變大。2.HE染色和天狼猩紅染色顯示,對照組小鼠肝組織標(biāo)本的肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞排列整齊且呈放射狀;與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞排列紊亂,體積變大,胞質(zhì)疏松呈現(xiàn)網(wǎng)狀,肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,且膠原沉積增多。3.羥脯氨酸測定結(jié)果顯示,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織樣本中羥脯氨酸含量增加到四倍左右。4.免疫組化、q RT-PCR和免疫熒光結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織中α-SMA和Col1α1的表達(dá)量明顯升高。5.對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織質(zhì)檢合格,用于后續(xù)芯片處理。6.芯片結(jié)果顯示,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組有266 lnc RNAs和1007 m RNAs被上調(diào),447 lnc RNAs and 519 m RNAs被下調(diào)。7.根據(jù)差異分析、GO分析、pathway分析、lnc RNA-m RNA共表達(dá)分析等篩選出10個(gè)lnc RNAs和10個(gè)m RNAs對芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;然后綜合臨近基因分析、micro-RNA結(jié)合位點(diǎn)分析及其長度等,進(jìn)一步篩選出一個(gè)上調(diào)(ENSMUST00000158992)和一個(gè)下調(diào)(NONMMUT045304)的lnc RNA進(jìn)行后續(xù)研究。8.CCl4模型(balb/c和C57)小鼠肝組織的q RT-PCR結(jié)果與芯片一致,證明芯片結(jié)果可靠。9.q RT-PCR結(jié)果證明,NONMMUT045304在肝臟中富集,同時(shí)根據(jù)其在肝纖維化中的作用將其命名為lnc-LFAR1(Liver Fibrosis Associated lnc RNA1);而ENSMUST00000158992沒有肝臟特異性;兩者在HSCs、HCs和Kuffers中均表達(dá)。10.RACE結(jié)果顯示ENSMUST00000158992長度為325bp,包含一個(gè)外顯子,無poly A尾;lnc-LFAR1長度為734bp,包含一個(gè)外顯子,且具有poly A尾。11.核漿定位證明lnc-LFAR1既存在于胞漿,又存在于胞核;ENSMUST00000158992主要存在于胞核。12.Coding Potential Calculator(CPC)軟件分析顯示,lnc-LFAR1包含有一個(gè)55aa的開放閱讀框,缺少Kozak序列(轉(zhuǎn)錄起始的一個(gè)重要原件);ENSMUST00000158992包含有一個(gè)68aa的開放閱讀框,缺少Kozak序列。13.熒光檢測試驗(yàn)證明,lnc-LFAR1沒有檢測到綠色熒光,即無蛋白編碼功能。14.在纖維化小鼠的原代HSCs和HCs,以及正常小鼠原代HSCs培養(yǎng)激活過程中檢測到lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992的表達(dá)均顯著增加。15.TGFβ處理后,lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992在正常小鼠的原代HSCs、HCs和AML12細(xì)胞中的表達(dá)量明顯升高。16.ENSMUST00000158992在肝纖維化病人血液中表達(dá)顯著增加。17.干擾掉lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992后,促肝纖維化相關(guān)基因被下調(diào),且抑制TGFβ對上述基因的上調(diào);過表達(dá)lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992的結(jié)果與干擾結(jié)果一致。結(jié)論1.CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型構(gòu)建成功。2.與正常小鼠相比,纖維化小鼠肝組織中有266個(gè)lnc RNAs和1007個(gè)m RNAs上調(diào),447個(gè)lnc RNAs和519個(gè)m RNAs下調(diào)。3.Lnc-LFAR1在肝臟中富集,且在纖維化小鼠肝臟中低表達(dá);ENSMUST00000158992在肝纖維化小鼠肝組織中高表達(dá)。4.Lnc-LFAR1長度為734bp,包含一個(gè)外顯子,且具有poly A尾,既存在于胞漿,又存在于胞核;ENSMUST00000158992長度為325bp,包含一個(gè)外顯子,無poly A尾,主要存在于胞核;且兩者均無蛋白編碼能力。5.lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992通過促進(jìn)HSCs的激活進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。
[Abstract]:Objective To investigate the expression of expression of 偽 - SMA and Col1偽1 in liver tissue of experimental group and control group . The expression of lnc RNA in liver tissue of experimental group was increased to about four times as compared with the control group . The results showed that the expression of lnc - LF1 and ENSMUST00000158992 was significantly increased in the livers of normal mice . ENSMUST00000158992 has a length of 325bp , contains an exon , no poly A tail , is mainly present in the nucleus , and both have no protein coding ability . 5.lnc - LF1 and ENSMUST00000158992 promote the development of liver fibrosis by promoting the activation of HSCs .
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575.2

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本文編號(hào)：2077213