發(fā)布時(shí)間：2018-06-10 12:55

  本文選題：芳香烴受體 + 鋅指蛋白�。� 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景及目的炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD),包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn's disease, CD),是一種慢性腸道特發(fā)性疾病。大量研究表明遺傳、環(huán)境及免疫因素均與IBD相關(guān)。其中,免疫調(diào)節(jié)紊亂目前被認(rèn)為是IBD發(fā)病的主要病因,但其發(fā)病機(jī)制仍未研究透徹。腸粘膜屏障(Intestinal mucosal barrier,IMB)包括機(jī)械屏障、免疫屏障、生物屏障及化學(xué)屏障,是腸上皮抵抗外源物質(zhì)的重要屏障。腸粘膜機(jī)械屏障由腸上皮細(xì)胞(Intestinal epithelial cell, IEC)及細(xì)胞之間的緊密連接(Tightjunction, TJ)構(gòu)成。其中,TJ起著重要的作用。研究表明,腸道炎癥與TJ之間有著密切的關(guān)系。IBD患者的腸道緊密連接嚴(yán)重破壞,腸道通透性明顯增加。另外,腸道緊密連接屏障的破壞會(huì)導(dǎo)致腸腔內(nèi)有毒分子的滲透,誘導(dǎo)粘膜免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng),引發(fā)腸道疾病甚至全身系統(tǒng)性疾病如全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)及多器官功能衰竭(Mutiply organ failure,MOF)。因此,目前認(rèn)為有效的抑制炎癥及維持腸粘膜屏障功能是目前治療IBD的主要策略。芳香烴受體(Aryl hydrocarbon receptor,AhR),是一種廣泛表達(dá)于機(jī)體各種細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子。AhR通過(guò)與配體結(jié)合活化的方式入核,與AhR核轉(zhuǎn)錄子(AhR nuclear translocator,ARNT)形成異源二聚體,特異性結(jié)合于AhR反應(yīng)原件,誘導(dǎo)包括細(xì)胞色素酶4501A1 (Cytochrome P450 1A1,CYP1A1)等一系列下游基因的表達(dá)。6-甲�；胚岵3,2-B]咔(6-formylindolo(3,2-b) carbazole,FICZ)是 AhR 的一種內(nèi)源性配體,研究表明,FICZ可以通過(guò)活化AhR參與細(xì)胞生理功能的維持,包括調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡,抑制免疫反應(yīng)等。目前多項(xiàng)研究表明AhR活化可以抑制腸道炎癥,但是其具體機(jī)制仍不清楚。另一方面,我們實(shí)驗(yàn)室的前期工作表明,AhR可以在腸梗阻模型中通過(guò)調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)和定位緩解腸粘膜屏障功能異常。因此,本課題通過(guò)模擬IBD動(dòng)物模型及體外細(xì)胞模型,采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting,WB)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time quantitation PCR,Real-time Q-PCR)、免疫組化(Immunohistochemical,IHC)、免疫熒光(Immunofluorescence,IF)、跨膜電阻測(cè)量等技術(shù),研究AhR活化減輕IBD腸道炎癥及緩解腸粘膜屏障功能異常的具體機(jī)制。方法1.建立小鼠DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型,通過(guò)給予小鼠FICZ腹腔注射處理,用小鼠體重改變、結(jié)腸長(zhǎng)度、死亡率、結(jié)腸形態(tài)學(xué)改變及炎癥因子表達(dá)來(lái)評(píng)估小鼠腸道炎癥的炎性損害情況。采用 Western blotting、Real-time Q-PCR、IHC 等技術(shù)檢測(cè) CYP1A1、(tristetraprolin) TTP、ZO-1、claudin-1、occludin 等的表達(dá)變化。使用 Ussing Chamber檢測(cè)小鼠結(jié)腸跨上皮電阻。觀察AhR活化對(duì)結(jié)腸炎炎癥及腸粘膜屏障功能的影響。2.建立腸上皮細(xì)胞系LPS干預(yù)模型,通過(guò)給予FICZ處理、siRNA干擾AhR處理后,采用 Western blotting、Real-time Q-PCR、IF 等技術(shù)檢測(cè) CYP1A1、TTP、MAPKAPK2、p-MAPKAPK2的表達(dá),探討AhR活化緩解結(jié)腸炎炎癥的機(jī)制。3.建立腸上皮細(xì)胞系TNF-α/IFN-γ干預(yù)模型,通過(guò)給予FICZ處理,用Western blotting、Real-time Q-PCR、IF 等技術(shù)檢測(cè) CYP1A1、ZO-1、claudin-1、occludin 等的表達(dá)變化,并檢測(cè)細(xì)胞的跨上皮電阻(TER),探討AhR活化維持腸粘膜屏障功能的具體機(jī)制。主要結(jié)果1.小鼠DSS模型中,相比于Sham組,DSS處理組小鼠體重明顯降低,死亡率增加,結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短,腸粘膜正常形態(tài)學(xué)改變(表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞融合脫落等)。小鼠結(jié)腸跨上皮電阻下降,腸粘膜通透性增加,腸粘膜屏障功能受損。而給予小鼠AhR激動(dòng)劑FICZ后,同DSS組相比較,小鼠體重有所回升,死亡率降低,結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增加,而腸粘膜損傷也有所緩解。小鼠結(jié)腸跨上皮電阻增加,腸粘膜屏障功能有所恢復(fù)。2.小鼠DSS模型中,給予FICZ可以顯著上調(diào)CYP1A1的表達(dá),活化AhR。并且可以上調(diào)RNA結(jié)合蛋白TTP的表達(dá)。3.體外LPS干預(yù)模型中,FICZ可以顯著上調(diào)TTP表達(dá)。siRNA干擾AhR后,TTP表達(dá)有所下降,并且給予FICZ不能上調(diào)TTP的表達(dá)。另一方面,FICZ可以抑制MK2的磷酸化。siRNA干擾AhR后,FICZ不再能抑制MK2的磷酸化。4.小鼠DSS模型中,DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎結(jié)腸上皮中緊密連接蛋白如ZO-1、claudin-1、occludin的表達(dá)有下降。而給予FICZ處理后可以顯著上調(diào)ZO-1、claudin-1、occludin的表達(dá)。5.體外TNF-α/IFN-γ干預(yù)模型中,相比于TNF-α/IFN-γ處理組,給予FICZ可以上調(diào)細(xì)胞的跨上皮電阻,并且可以緩解ZO-1的結(jié)構(gòu)破壞。另一方面,FICZ可以增加MLC的磷酸化。結(jié)論1. FICZ在體內(nèi)體外模型中均可以活化AhR。2. AhR活化可以緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎炎癥及腸粘膜屏障功能異常。3. MK2/p-MK2 /TTP通路參與了 AhR調(diào)控腸道炎癥的過(guò)程。4. AhR活化可以減少炎癥因子導(dǎo)致的腸上皮中緊密連接蛋白表達(dá)的下降及定位的改變。5. MLCK/p-MLC通路可能參與了 AhR調(diào)控緊密連接蛋白,緩解腸粘膜屏障功能異常的過(guò)程。
[Abstract]:Background and objective Inflammatory bowel disease (IBD), including ulcerative colitis (Ulcerative colitis, UC) and Crohn's disease (Crohn's disease, CD). It is a chronic intestinal idiopathic disease. A large number of studies have shown that heredity, environment and immuno factor are associated with IBD. The main cause of disease, but its pathogenesis is still not thoroughly studied. The intestinal mucosal barrier (Intestinal mucosal barrier, IMB), including mechanical barriers, immune barriers, biological barriers and chemical barriers, is an important barrier to the resistance to exogenous substances in the intestinal epithelium. The intestinal mucosal mechanical barrier consists of the intestinal epithelial cells (Intestinal epithelial cell, IEC) and the cells. Tightjunction (TJ) composition. Among them, TJ plays an important role. Studies have shown that intestinal inflammation and TJ have a close relationship with the severe disruption of the intestinal close connections in.IBD patients and the obvious increase in intestinal permeability. In addition, the destruction of the intestinal tight junction barrier can lead to the infiltration of toxic molecules in the intestinal cavity and induce the mucosal immune system. Systemic and inflammatory reactions lead to intestinal diseases and even systemic diseases such as systemic inflammatory response syndrome (Systemic inflammatory response syndrome, SIRS) and multiple organ failure (Mutiply organ failure, MOF). Therefore, it is considered that effective inhibition of inflammation and intestinal mucosal barrier function is the main strategy for the treatment of IBD. Aryl hydrocarbon receptor (AhR) is a transcriptional factor that is widely expressed in various cells of the body and.AhR is activated by ligand binding to the ligand and forms a heterogenous two polymer with the AhR nuclear transcriptome (AhR nuclear translocator, ARNT). P450 1A1, CYP1A1), such as the expression of a series of downstream genes,.6- formyl indole and [3,2-B] carbazole (6-formylindolo (3,2-b) carbazole, FICZ) is an endogenous ligand for AhR. The study shows that FICZ can be involved in the maintenance of cell physiological function by activating AhR, including regulating cell proliferation, apoptosis, inhibiting immune response and so on. AhR activation can inhibit intestinal inflammation, but its specific mechanisms are still unclear. On the other hand, our laboratory earlier work showed that AhR could alleviate intestinal mucosal barrier dysfunction by regulating the expression and localization of tight connexin in the intestinal obstruction model. Therefore, this lesson is done by simulating the IBD animal model and in vitro cell model, Western blotting (WB), real-time quantitative polymerase chain reaction (Real-time quantitation PCR, Real-time Q-PCR), immunohistochemistry (Immunohistochemical, IHC), immunofluorescence (Immunofluorescence, IF), and transmembrane resistance measurements were used to study the reduction of intestinal inflammation and intestinal mucosal barrier work Method 1. the model of DSS induced colitis in mice was established. By intraperitoneal injection of FICZ in mice, the mice weight change, colon length, death rate, colonic morphological change and inflammatory factor expression were used to evaluate the inflammatory damage of intestinal inflammation in mice. Western blotting, Real-time Q-PCR, IHC and so on were used. CYP1A1, (tristetraprolin) TTP, ZO-1, claudin-1, occludin and other expression changes. Use Ussing Chamber to detect the cross epithelial resistance of the colon in mice. Observe the effect of AhR activation on inflammation of colitis and intestinal mucosal barrier function,.2. to establish the LPS intervention model of the intestinal epithelial cell line. Western blotting, Real-time Q-PCR, IF and other techniques were used to detect the expression of CYP1A1, TTP, MAPKAPK2, p-MAPKAPK2, and to explore the mechanism of AhR activation to alleviate inflammation of the colitis. The expression changes of DIN and other cell resistance (TER) were detected and the specific mechanism of AhR activation to maintain intestinal mucosal barrier function was explored. The main results in 1. mice DSS model, compared with the Sham group, the weight of the mice in the DSS treatment group decreased significantly, the mortality rate increased, the colon length shortened obviously, and the intestinal mucosa normal morphological changes (showing inflammation fine). The resistance of the colon of mice decreased, the permeability of intestinal mucosa increased and the intestinal mucosal barrier function was damaged. After the mice were given AhR agonist FICZ, the weight of mice increased, the death rate decreased, the colon length increased obviously, and the intestinal mucosa damage was also relieved. The colon of mice was on the upper part of the colon. The skin resistance increased and the intestinal mucosal barrier function recovered in the DSS model of.2. mice. FICZ could significantly up-regulate the expression of CYP1A1, activate AhR. and increase the expression of RNA binding protein TTP in the LPS intervention model in vitro. FICZ can significantly increase TTP expression.SiRNA interference. On the other hand, FICZ can inhibit MK2 phosphorylation.SiRNA interference AhR, FICZ no longer inhibits the DSS model of MK2 phosphorylated.4. mice, and DSS induced colonic colonic epithelium in colon epithelium, such as ZO-1, claudin-1, decreased. In the TNF- alpha /IFN- gamma intervention model of.5. in vitro, compared to the TNF- alpha /IFN- gamma treatment group, FICZ can increase the cross epithelial resistance of the cells and alleviate the structural damage of ZO-1. On the other hand, FICZ can increase the phosphorylation of MLC. Conclusion 1. FICZ can be activated by activation of AhR.2. AhR in vivo and in vitro models. Inflammation of enteritis and intestinal mucosal barrier function.3. MK2/p-MK2 /TTP pathway participates in the process of AhR regulation of intestinal inflammation,.4. AhR activation can reduce the decrease and localization of the expression of tight connexin in the intestinal epithelium caused by inflammatory factors, the.5. MLCK/p-MLC pathway may participate in the AhR regulated tight connexin and alleviate the intestinal mucosal screen. The process of abnormal dysfunction.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R574

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本文編號(hào)：2003296