本文選題：LO2細胞 + 過氧化損傷　； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：背景： 胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是2型糖尿病、冠心病、高血壓等慢性疾病的共同機制及危險因素。有研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷應激等條件下,機體亦表現(xiàn)出一定程度的胰島素抵抗并直接影響大手術(shù)、創(chuàng)傷的預后。近年來,胰島素抵抗與缺血再灌注相關(guān)性的研究逐漸成為新點、熱點之一,有研究證實肝臟缺血再灌注后存在高血糖現(xiàn)象,其產(chǎn)生機制眾說不一：Zanaro NL[3]認為是肝缺血再灌注過程中所產(chǎn)生的炎性細胞因子(如TNF-a等)繼發(fā)性地誘導內(nèi)源性兒茶酚胺、皮質(zhì)醇和胰高血糖素等抗胰島素激素分泌引起的結(jié)果；Choi CS[4]認為是恢復血流前使用大劑量類固醇激素所致；Nowsk G[5]認為是肝臟貯存的肝糖元分解、集中釋放所致。胰島素抵抗包括受體前、受體、受體后三個水平,受體前水平IR主要與在體各種抵抗激素的釋放有關(guān),而受體及受體后水平IR主要與胰島素-胰島素受體(insulin receptor,IR)-受體底物(IR substrates,IRSs)-PI3-kinase-蛋白激酶B(phospho-Protein Kinase B,PKB/AKT)信號系統(tǒng)有關(guān)。有研究顯示,此信號系統(tǒng)任何靶蛋白分子表達下降均可以引起胰島素抵抗。胰島素受體錨定在細胞膜上,細胞膜流動性及結(jié)構(gòu)的破壞勢必會損害細胞膜功能,進而影響胰島素受體表達。因此,同步檢測培養(yǎng)基中殘余葡萄糖含量,反映細胞膜改變的Annexin-V表達、細胞形態(tài)學改變、細胞增殖抑制率變化等指標,有可能在一定程度上反映出細胞是否出現(xiàn)受體水平的胰島素抵抗現(xiàn)象。胰島索受體由α、p各兩個亞基組成,其中p亞基是發(fā)揮胰島素細胞膜與細胞內(nèi)效應的功能單位,因此該指標是反映受體水平胰島素抵抗的特異性敏感指標。AKT時胰島素信號通路上的關(guān)鍵信號分子,它的磷酸化可激活葡萄糖轉(zhuǎn)運子,進而啟動葡萄糖由膜外向膜內(nèi)轉(zhuǎn)運,因此,通過在檢測上述指標同時,同步觀察P-AKT的表達變化可以反映出受體后水平的胰島素抵抗現(xiàn)象。本課題組前期動物實驗研究已初步證實,大鼠肝缺血再灌注時,可出現(xiàn)受體前水平的胰島素抵抗現(xiàn)象(論文待發(fā)表)。肝臟的缺血再灌注損傷本質(zhì)上主要是因缺血缺氧、脂質(zhì)過氧化自由基大量生成造成的肝實質(zhì)細胞遭受過氧化損傷,離體肝實質(zhì)細胞在過氧化損傷時是否存在胰島素抵抗現(xiàn)象尚有待進一步證實。為證實過氧化損傷是否確實會引發(fā)肝細胞出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象,以及其發(fā)生機制,本課題試圖在體外實驗中利用過氧化氫(H202)處理人正常肝細胞(L02細胞)制作過氧化損傷模型,觀察L02細胞在遭受過氧化損傷時過氧化損傷指標丙二醛(MDA)、胰島素抵抗指標培養(yǎng)基中殘余葡萄糖、凋亡指標膜聯(lián)蛋白V (Annexin5)表達、細胞的生存率及細胞形態(tài)學的變化、InsRβ及AKT的表達,證實L02細胞過氧化損傷時是否存在受體及受體后水平葡萄糖利用障礙的胰島素抵抗現(xiàn)象,初探其可能機制,為臨床上防治缺血再灌注損傷提供新思路。 材料和方法： 1.材料：L02細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢),過氧化氫購自國藥集團化學試劑有限公司,Dmem/High Glucose培養(yǎng)基和改良型RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；批次號：110311；胰酶購自Amresco,貨號：0457；葡萄糖測定試劑盒購自上海名典生物工程有限公司；丙二醛(malondialdehyde, MDA)測定試劑盒購自南京建成科技有限公司。 2.細胞培養(yǎng)：①培養(yǎng)瓶中的細胞覆蓋率達到80%-90%時進行傳代。②吸棄原有培養(yǎng)基,加入2ml的PBS清洗細胞后棄掉。③加適當?shù)囊鹊鞍酌?能覆蓋細胞就行),消化1-2分鐘。④細胞都變圓后吸出胰酶終止消化。⑤加入3ml的完全培養(yǎng)基,移液槍吹打細胞,把細胞都懸浮起來。⑥把細胞傳到3個相同規(guī)格的培養(yǎng)瓶中,置于37℃,5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。⑦以生長穩(wěn)定的3-5代細胞制備細胞懸液,接種于6孔板,每孔細胞數(shù)約為5×105個,用于實驗。 3.實驗分組：實驗設3組：①A組：L02細胞正常培養(yǎng)24h不加H2O2處理,②B組：L02細胞正常培養(yǎng)24h后力160μmol/LH2O2,③C組：L02細胞正常培養(yǎng)24h后加入517μmol/LH202。分別于0、12、24h收集細胞及上清,采樣待測。 4.過氧化損傷模型的制作：預實驗——用不同濃度的H202作用于L02細胞,Oh、12h、24h后MTT試驗計算其抑制率,據(jù)結(jié)果選取合適的濃度160μmol/LH2O2(24h抑制率為35.8%)、517μmol/L(24h抑制率為50%)用于試驗。接種細胞于6孔板,培養(yǎng)24h后,分別加入不同濃度的H202,制作不同程度的細胞過氧化損傷模型。 5.葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法(GOD-POD)檢測細胞上清液殘余葡萄糖含量：將試劑1與試劑2按4：1比例混合配制成工作液,并平衡至測定溫度,每個細胞培養(yǎng)瓶中取10μl上清液加入全自動生化分析儀中。測定培養(yǎng)液殘存葡萄糖含量,單位為mmol/L 6.硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(MDA)含量：將收集的細胞,4℃冰箱保存,按試劑盒說明用硫代巴比妥酸法檢測丙二醛。用紫外分光光度計532nm處,1cm光徑,蒸餾水調(diào)零,測各管吸光度值,用標準空白管代替測定空白管,MDA含量=測定管吸光度-測定空白管吸光度／標準管吸光度-標準空白管吸光度×標準品濃度／蛋白含量。 7. RT-PCR法檢測Annexin5的表達：按試劑盒說明書進行操作提取純化總RNA,用RT-PCR試劑盒檢測L02細胞Annexin5表達情況。引物由Invitrogen Biotechnology Co.,LTD中國公司合成,Annexin5的mRNA序列號XM_001154,其上游引物為：5'-TTATCACCATCTTTGGAACACG-3',下游引物為：5'-CTTCCTAAACTCCTTCCTGATGT-3'。β-actin的mRNA序列號XM001101,其上游引物為：5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3',下游引物為5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'.先以總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應,然后以cDNA為模板采用RT-PCR試劑盒(TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR MixQPS-201)在SLAN熒光定量PCR檢測系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR反應,反應條件為：95℃預變性1min,95℃變性15s,58℃退火20s,72℃延伸20s,共40個循環(huán),72℃末段延伸5min。擴增完畢后進行溶解曲線分析,采用相對定量法以actin為內(nèi)參照,利用CT值計算Annexin5mRNA相對表達量：表達量=2-ΔΔCT(△CT=CT目的基因-CT內(nèi)標基因,△△CT=△CT待測樣本-ACT對照樣本)。 8免疫印跡法(Western Blot)檢測胰島素受體p(insulin receptor β,InsRβ)和磷酸化蛋白激酶B(phospho-Protein Kinase B, PKB/AKT)的表達：反復吹打完全裂解細胞,12000r/min離心5min,收集上清,即為總蛋白溶液。采用Bradford方法測定蛋白質(zhì)濃度,計算含40μg蛋白的溶液體積即為上樣量。采用分離膠濃度為10%,濃縮膠濃度為5%的十二烷基硫化鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,分離后進行轉(zhuǎn)膜(PVDF膜在使用之前先用甲醇活化,按照200mA、1h的條件進行轉(zhuǎn)膜)、5%的脫脂牛奶室溫封閉30min后分別加入稀釋500倍的InsRβ和PAKT抗體,室溫下孵育2h,用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次,每次5min,將二抗用TBST稀釋3000倍,室溫下孵育45min,用0.5‰TBST在室溫下脫色搖床上洗三次,每次5min,洗膜后加入二抗孵育。用化學發(fā)光法試劑作用后,X線膠片曝光,經(jīng)顯影、定影處理后觀察結(jié)果。凝膠成像及分析系統(tǒng)掃描圖像,以Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值,對樣本和內(nèi)參的比值進行比較分析。 9.MTT實驗檢測細胞抑制率：①將復合材料剪成96孔培養(yǎng)板孔洞大小,用75%乙醇和紫外燈消毒,干燥。放于96孔培養(yǎng)板中1排的2-6孔中。②取調(diào)整好密度為5×104/mL的細胞接種于放置材料的孔中,每孔接種0.2ml,即每孔104個細胞。1和7孔加入無細胞培養(yǎng)液提供濕環(huán)境。將培養(yǎng)板放入C02孵箱,在37℃、5%C02及飽和濕度條件下孵育24h以貼壁。③待細胞貼壁過夜后,分別加入不同濃度H2O2(0μmol/LH2O2、160μmol/LH2O2、517μmol/LH2O2),培養(yǎng)24h,同時設不加藥的對照組和和只加培養(yǎng)液的調(diào)零孔,每個樣本濃度設三個重復。④培養(yǎng)相應時間后,取一培養(yǎng)板,每孔加入MTT溶液(5mg/ml)50μl培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加200μl DMSO(二甲基亞砜),震蕩10min,將細胞內(nèi)和細胞周圍的MTT-甲zs顆粒充分溶解。⑤選擇570nm波長,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(A),記錄結(jié)果,計算平均值,并與對照組進行比較。 10.形態(tài)學觀察：接種細胞于6孔板中,培養(yǎng)24h后,加入不同濃度H202處理,24h后用倒置顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)。 11.統(tǒng)計學方法：所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,多組樣本比較采用方差分析(組間比較：方差齊采用LSD法,方差不齊采用Games-Howell法),以P0.05為差異有顯著性的判定標準。 結(jié)果： 1.上清液殘余葡萄糖含量：A組殘余葡萄糖含量自Oh(3.24±0.08)至24h(0.98±0.03)呈一直線下降趨勢即與Oh比較有極顯著差異(P0.01),說明葡萄糖得到較充分利用；B、C組雖亦呈下降趨勢,但在12h(2.71±0.08,2.90±0.09)、24h(2.18±0.03,2.34±0.06)兩個觀察時限點下降幅度B組低于A組(P0.01),而C組低于B組。 2丙二醛(MDA)含量：0h三組間MDA含量無明顯差異,B組MDA含量12h(0.63±0.02)明顯增高,至24h(0.72±0.04)繼續(xù)呈上升趨勢,與A組(0.49±0.05)比較有顯著差異(P0.01)；C組在12h(0.71±0.03)其含量陡然上升,不僅高于A組(0.50±0.03)(P0.01),而且顯著高于B組,但至24h(0.62±0.02)呈下降趨勢,略低于B組,但仍高于A組。 3. Annexin5的表達：0h三組間Annexin5mRNA的表達水平無明顯差異,B組其表達水平12h(2.51±0.07)明顯增高,至24h(2.83±0.04)繼續(xù)呈上升趨勢,與A組(1.00±0.00)比較有顯著差異(P0.01)；C組在12h(2.81±0.07)其表達水平陡然上升,不僅高于A組(P0.01),而且顯著高于B組,但至24h(1.67±0.04)呈下降趨勢,略低于B組,但仍高于A組。 4. InsRβ、p-AKT表達：在各組間0h及A組各時間點InsRβ、p-AKT表達無明顯差異(P0.05),B組InsRβ、p-AKT表達12h(0.33±0.02、0.25±0.02)明顯降低,至24h(0.2±0.03、0.1±0.02)繼續(xù)呈下降趨勢,與A組(0.47±0.02、0.41±0.04)比較有顯著差異(P0.01)；C組InsRβ、p-AKT在12h(0.2±0.02、0.14±0.01)其表達陡然下降,不僅低于B組(0.33±0.02、0.25±0.02)(P0.01),而且顯著低于A組(0.47±0.03、0.4±0.09)(P0.01),至24h(0.13±0.02、0.06±0.02)繼續(xù)呈下降趨勢,略低于B組(0.22±0.03、0.16±0.02)(P0.01),顯著低于A組(0.47±0.02、0.41±0.04)(P0.01)。 5.細胞抑制率及光鏡下細胞形態(tài)：0h三組間抑制率無差異,A組在0-24h抑制率均為0.00%,鏡下細胞生長態(tài)勢良好,貼壁生長,排列緊密,細胞輪廓清楚,形態(tài)正常；B、C組抑制率均呈上升趨勢,在12h(10.7%,49.3%)、24h(31.1%,59.5%)兩個觀察時限點抑制率B組高于A組(P0.05),而C組高于B組(P0.05)。B組24h鏡下細胞之間空隙增大,形態(tài)模糊,可見少量漂浮細胞；C組24h鏡下細胞稀疏,可見大量漂浮細胞,折光變?nèi)?細胞質(zhì)見顆粒存積。 結(jié)論： 本實驗結(jié)果顯示L02細胞在遭受一定程度的過氧化損傷時,MDA增多、細胞抑制率增加、Annexin5表達增強,細胞攝取和利用葡萄糖減少,培養(yǎng)基中殘余葡萄糖含量增多,出現(xiàn)葡萄糖利用減少的胰島素抵抗現(xiàn)象；同時觀察到L02細胞過氧化損傷時,發(fā)生脂質(zhì)過氧化,細胞形態(tài)發(fā)生改變,膜上InsRβ表達減少,提示這種胰島素抵抗現(xiàn)象與受體表達下降有關(guān),即出現(xiàn)受體水平的胰島素抵抗現(xiàn)象；另外,AKT的磷酸化在啟動受體后葡萄糖的轉(zhuǎn)運起著至關(guān)重要作用,實驗發(fā)現(xiàn)磷酸化的AKT相應地表達降低,提示過氧化損傷不僅可造成肝細胞胰島素受體水平的胰島素抵抗,而且可導致受體后水平的胰島素抵抗現(xiàn)象。總之,這些結(jié)果可以為我們在臨床上從改善過氧化損傷時受體及受體后水平胰島素抵抗角度防治缺血再灌注損傷提供新思路。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575

【參考文獻】

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本文編號：1999248