本文選題：腸缺血再灌注 + 禁食誘導(dǎo)的脂肪因子　； 參考：《大連醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：腸缺血再灌注(Intestinal ischemia reperfusion, Ⅱ/R)損傷引發(fā)小腸屏障功能障礙并導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的病理過程是臨床外科及重癥監(jiān)護室(Intensive care unit, ICU)常見的病理過程。有較高的死亡率和并發(fā)癥率,而急性腸系膜栓塞導(dǎo)致的死亡率則高達60-80%。腸I/R引發(fā)的小腸屏障功能障礙是MODS發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。機械屏障是小腸屏障最為重要的組成部分。它是由小腸上皮細胞、緊密連接(tightjunction, TJ)和細胞間粘附分子構(gòu)成的一個選擇性的滲透性屏障。完整的腸屏障能有效阻止病原入侵并維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。炎癥和氧化級聯(lián)均能夠破壞小腸屏障,新近的研究認為,過度活化的凋亡(apoptosis)與自噬(autophagy)也可直接破壞小腸屏障,而肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin light-chain kinase, MLCK)調(diào)節(jié)的緊密連接信號則被認為是調(diào)控小腸屏障的關(guān)鍵因素。其中,緊密連接蛋白ZO-1和咬合蛋白(Claudin)-2在腸I/R損傷中呈現(xiàn)特殊性的分布和損耗。肺是腸I/R引起的遠隔臟器損傷中最嚴重的器官之一,急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是腸I/R引起急性呼吸窘迫綜合鉦(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的中間環(huán)節(jié)。腸I/R破壞小腸屏障,導(dǎo)致菌群移位,炎性細胞因子及趨化因子等有害產(chǎn)物侵及淋巴途徑,回流至胸導(dǎo)管導(dǎo)致肺臟損傷。該過程中,巨噬細胞活化是必不可少的。肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages, AMs)參與肺泡微循環(huán)的破壞。活化的巨噬細胞還充當介質(zhì)誘導(dǎo)中性粒細胞活化,釋放多重炎性細胞因子及趨化因子等最終導(dǎo)致ALI。已有研究報道,抑制AMs減輕多種動物模型包括肺I/R模型導(dǎo)致的肺損傷。但是該觀點存在爭議,分子水平的信號機制仍未闡明。此外,腸I/R還可以導(dǎo)致遠隔臟器如肝和腎等臟器的序貫性損害并最終導(dǎo)致MODS。因此,針對始動器官小腸進行干預(yù)至關(guān)重要。過去的研究認為,凋亡是小腸I/R后腸上皮細胞死亡的主要形式,進一步研究發(fā)現(xiàn)自噬也直接破壞小腸屏障。但是抑制細胞凋亡與自噬并不能完全逆轉(zhuǎn)小腸I/R導(dǎo)致的多器官損傷。最新近的研究表明,壞死性凋亡(necroptosis)不僅參與小腸炎癥性疾病,還導(dǎo)致系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)并增加小鼠死亡率。其確切調(diào)控機制并不清楚,但該通路是由TNF(α)與TNF受體結(jié)合所介導(dǎo),并由受體相關(guān)蛋白-3(receptor-interacting protein 3, RIP3)、半胱天冬酶caspase-8與混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域樣(mixed lineage kinase domain like, MLKL)蛋白三個關(guān)鍵分子所調(diào)節(jié)。該信號通路的活化不依賴于傳統(tǒng)的細胞凋亡,也獨立于經(jīng)典的壞死途徑。已有研究報道,雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎中出現(xiàn)細胞壞死性凋亡現(xiàn)象。因此,壞死性凋亡可能在腸I/R引發(fā)的多器官損傷中具有重要價值。禁食誘導(dǎo)的脂肪因子(fasting-induced adipose factor, FIAF),又稱血管生成素樣因子4(angiopoietin-like 4, ANGPTL4),是參與維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、創(chuàng)傷修復(fù)、細胞凋亡等過程的重要因子。FIAF可能在腸I/R多器官損傷中具有核心價值。首先,FIAF是可以由小腸絨毛上皮產(chǎn)生并分泌入血的一種分泌性蛋白。缺血或低氧可以誘導(dǎo)FIAF釋放入血,FIAF還保護輻射誘導(dǎo)的小腸上皮細胞凋亡。FIAF維持血-腦屏障功能并調(diào)節(jié)ZO-1表達,降低滲透性�；蛟S能維持腸屏障的完整性。其次,FIAF參與巨噬細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),并在小腸淋巴系統(tǒng)的發(fā)育過程中是必不可少的。FIAF保護LPS誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細胞炎性損傷。FIAF缺陷加重高脂飲食誘發(fā)的小鼠腸系膜淋巴結(jié)的巨噬細胞的慢性重癥炎癥。而FIAF缺陷的小鼠由于小腸淋巴系統(tǒng)的發(fā)育不完整性在生后3周便出現(xiàn)免疫缺陷而死亡。這提示FIAF可能在淋巴途徑介導(dǎo)的,并依賴于巨噬細胞活化的腸I/R肺損傷中具有重要價值。最后,FIAF抑制TNF-α的釋放或可阻斷腫瘤壞死因子與TNF受體結(jié)合,進而抑制RIP1和RIP3激活,恢復(fù)caspase-8的減少,同時抑制MLKL蛋白活性,最終抵抗細胞壞死性凋亡。據(jù)此,我們認為,FIAF在腸I/R所致腸屏障功能障礙多器官損傷中具有重要的核心作用,對其進行調(diào)控能有效改善腸屏障功能障礙所致的多器官損傷。直接誘導(dǎo)或者間接誘導(dǎo)FIAF均能改善腸道屏障功能,進而通過不同機制改善遠隔器官的損傷。魚油,主要成分為ωω-3多不飽和脂肪酸(Omega-3 polyunsaturated fatty acids, ω-3PUFAs),已被廣泛用于危重疾病包括肺疾病的治療干預(yù)。臨床應(yīng)用魚油的優(yōu)點目前仍然存在爭議。但已有研究表明ω-3PUFAs對I/R疾病具有保護作用。并且,ω-3PUFAs是FIAF的強誘導(dǎo)劑,可能抑制腸I/R肺損傷中巨噬細胞炎癥反應(yīng)。但也有研究認為,co-3PUFAs以AMPK/SIRT1通路依賴性的方式拮抗巨噬細胞炎癥。因此,ω-3PUFAs可能通過AMPK/SIRT1通路和誘導(dǎo)FIAF減輕腸I/R肺損傷。天然生草本植物生源禪寧A(biochanin A, BCA)與姜黃同屬多酚類化合物,也是PPAR活化劑并保護炎癥、燒傷等危重疾病狀態(tài),可能誘導(dǎo)FIAF表達,并且多酚化合物姜黃抑制神經(jīng)細胞的壞死性凋亡已有報道。因此,BCA可能誘導(dǎo)FIAF并抑制壞死性凋亡進而減輕腸I/R多器官損傷�；诖�,本研究分別采用小鼠、大鼠建立腸I/R模型,并選擇小腸上皮Caco-2細胞及人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)建立低氧復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)模型。采用western blot、real-time PCR、RNA干擾等先進分子生物學方法并加用PPAR抑制劑,先后探討：一、FIAF在腸I/R小腸屏障功能障礙中的作用及機制。二、ω-3PUFA直接誘導(dǎo)FIAF抑制巨噬細胞炎癥保護腸I/R屏障功能障礙肺損傷中的作用和機制。三、間接(生源禪寧A)誘導(dǎo)FIAF抑制壞死性凋亡進而保護腸I/R多器官損傷作用及機制。本研究將為FIAF在腸I/R多器官損傷中的作用提供理論依據(jù),有利于實現(xiàn)科技成果轉(zhuǎn)化。第一部分、Rh FIAF減輕腸I/R誘發(fā)的腸屏障結(jié)構(gòu)和功能障礙目的：探討FIAF在大鼠腸I/R引發(fā)的腸屏障功能障礙中的作用及外源性的應(yīng)用人重組的FIAF對大鼠腸屏障功能障礙的保護作用及機制。方法：健康雄性Wistar大鼠24只,隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、腸I/R組(I/R+vehicle織.)、Rh FIAF組(I/R+Rh FIAF組)。Megison法構(gòu)建小腸I/R模型,行腸系膜上動脈夾閉1h,再灌注4h。Rh FIAF組于再灌注起始給予尾靜脈注射(RhFIAF 28mg/kg,溶于二甲基亞砜：dimethyl sulfoxide,DMSO),假手術(shù)組和腸I/R組給予相同劑量的溶媒(vehicle,0.1%DMSO)。觀察小腸組織病理學變化,檢測TNF-α、IL-6,lL-1β和MDA水平；自噬(Beclin-1、LC3I、LC3II和P62)與凋亡(Cleaved caspase-3/caspase-3)水平；屏障結(jié)構(gòu)(MLCK、p-MLC/t-MLC、ZO-1和Claudin-2)和功能(FD4清除率及血管滲透性E-cadherin);小腸組織FIAF蛋白和mRNA變化。結(jié)果：1、與Sham組相比,I/R組：小腸絨毛排列紊亂、頂端斷裂,粘膜及粘膜下間隙出血、水腫,上皮下間隙增寬；血清和小腸NF-α、IL-6、IL-1p(P0.01)、MPO及MDA水平升高(P0.05)；同時自噬(Bectin-1、LC3I、LC3II升高、P62降低)與凋亡(凋亡細胞數(shù)及Cleaved caspase-3/caspase-3升高)增加(P0.05)。屏障結(jié)構(gòu)(MLCK、p-MLC/t-MLC增高；ZO-1、Claudin-2降低)和功能(FD4清除率增加及E-cadherin減少)削弱(P0.01)。小腸組織FIAF蛋白和mRNA表達增高(P0.05)。2、與1/R組相比,Rh FIAF組：小腸絨毛排列紊亂程度、頂端斷裂、粘膜及粘膜下間隙出血及水腫程度均減輕,上皮下間隙無明顯增寬；血清和小腸TNF-α、IL-6、IL-1p、MPO及MDA水平均下降(P0.05)：小腸自噬(Beclin-1、LC3I、LC3II降低、P62升高)與凋亡(凋亡細胞數(shù)與Cleaved Caspase-3)均降低(P0.05)。屏障結(jié)構(gòu)(MLCK、p-MLC/t-MLC降低；ZO-1、Claudin-2增高)和功能(FD4清除率降低及E-cadherin增加)恢復(fù)(P0.01)。結(jié)論：1、腸I/R導(dǎo)致腸粘膜屏障和血管內(nèi)皮屏障結(jié)構(gòu)和功能破壞、加劇炎癥級聯(lián)和氧化應(yīng)激、過度活化自噬與凋亡并降低生存率。2、人重組的FIAF保護腸I/R損傷誘導(dǎo)的腸屏障功能障礙,改善生存率。其機制可能是通過抑制腸上皮細胞的過度自噬與凋亡,減輕炎癥和氧化級聯(lián)；抑制MLCK通路進而調(diào)節(jié)ZO-1和Claudin-2表達,從而改善小腸屏障結(jié)構(gòu)和功能。第二部分、o-3 PUFA直接誘導(dǎo)FIAF并活化AMPK/SIRT1通路減輕腸缺血再灌注肺損傷目的：活化的巨噬細胞的毒性產(chǎn)物通過淋巴系統(tǒng)侵及肺臟是腸I/R誘發(fā)急性肺損傷(acute lung injury,ALI)的最重要的發(fā)病機制。αω-3多不飽和脂肪酸(Omega-3polyunsaturated fatty acids,o-3 PUFAs)是針對巨噬細胞炎癥的腺苷-5'-單磷酸活化蛋白激酶/沉默信息調(diào)節(jié)因子1(adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase/sirtuin1, AMPK/SIRT1)通路的強效激活劑,且能誘導(dǎo)FIAF表達,本研究探討ω-3PUFAs是否可以通過AMPK/SIRT1通路或(和)誘導(dǎo)FIAF預(yù)防腸I/R所致的ALI。方法：使用雄性Wistar大鼠構(gòu)建腸I/R模型,夾閉腸系膜上動脈60分鐘后予以再灌注240分鐘。魚油乳劑(fish oil emulsion, FO,主要成分為ω-3 PUFAs)或生理鹽水(對照組)1ml/d連續(xù)三天給予腹腔注射。再灌注結(jié)束時處死所有動物。收集血液和組織樣品用于后續(xù)檢測分析。結(jié)果：腸I/R引發(fā)嚴重的小腸和肺損傷,可見嚴重的肺組織水腫和巨噬細胞浸潤。FO預(yù)處理維持了小腸和肺部微觀結(jié)構(gòu)的完整性。腸I/R誘導(dǎo)的巨噬細胞衍生的介質(zhì)巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)和巨噬細胞趨化蛋白-1 (macrophage chemoattractant protein-1, MCP-1)、炎性標志物(NFκB,TNF-α,IL-6和IL-1 β)、以及促凋亡因子p66shc(P0.01,P0.01；P0.01,P0.05,P0.05,P0.05；P0.01)的表達增加。但AMPK, SIRT1和Claudin-5的表達下降并且FIAF表達升高(P0.01)。FO顯著抑制肺組織巨噬細胞浸潤,炎性標志物的表達和p66shc磷酸化(P0.01；P0.05；P0.05)。并且,FO還恢復(fù)了肺組織AMPK, SIRT1和Claudin-5的表達并進一步誘導(dǎo)了FIAF的表達增加(P0.01,P0.01,P0.05；P0.05)。結(jié)論：FO預(yù)處理可有效保護大鼠腸I/R引發(fā)腸和肺損傷,減少巨噬細胞浸潤,抑制炎癥反應(yīng),抑制肺細胞凋亡,且誘導(dǎo)FIAF表達：并以AMPK/SIRT1依賴的方式改善腸I/R后肺血管內(nèi)皮屏障損傷。因此,研究和開發(fā)AMPK/SIRT1或(和)FIAF作為新的靶標對于腸I/R誘導(dǎo)的ALI患者的治療具有重要意義。第三部分、 生源禪寧A誘導(dǎo)FIAF抑制壞死性凋亡途徑減輕腸I/R多器官損傷目的：探討FIAF調(diào)節(jié)的壞死性凋亡途徑在腸I/R多器官損傷中的作用；生源禪寧A誘導(dǎo)FIAF抑制壞死性凋亡在腸I/R多器官損傷中保護作用及可能機制。方法：1、生源禪寧A對腸I/R多器官損傷的保護作用及機制研究。健康雄性C57BL/6J小鼠24只,隨機分成以下三組：假手術(shù)組(sham組)；腸I/R組(I/R+vehicle組)；BCA預(yù)處理組(BCA組)。小腸I/R模型的構(gòu)建同第一部分,BCA組在缺血模型構(gòu)建前給予BCA50mg/kg/d腹腔注射,對照組給予相同劑量的DMSO,連續(xù)5天,再構(gòu)建I/R模型。觀察小腸及肝肺腎組織病理學變化；檢測ALT、AST水平；BALFP含量；血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平；NF-α和IL-6水平,檢測小腸壞死性凋亡(RIP3、MLKL和caspase-8); FIAF, PPARα、 PPARβ和PPARγ蛋白表達；FIAF mRNA表達。2、為明確BCA對Caco-2細胞H/R損傷的保護作用及其機制,采用小腸上皮Caco-2細胞建立H/R模型,采用BCA預(yù)處理、RNA干擾、不同PPAR亞型抑制劑干預(yù),并采用MTT、western blot、real-time PCR等方法檢測目的分子的蛋白和mRNA含量。篩選合適BCA濃度與作用時間后,先后探討：1)、BCA通過不同PPAR亞型誘導(dǎo)Caco-2細胞FIAF mRNA表達。2)、FIAF蛋白和mRNA在Caco-2細胞不同時間H/R刺激后的表達。3)、BCA對H/R刺激引發(fā)的Caco-2細胞壞死性凋亡的抑制作用。4)、BCA對H/R刺激的Caco-2細胞FIAF蛋白和mRNA表達的影響。5)、FIAF在BCA減輕H/R刺激的小腸上皮細胞壞死性凋亡中的作用。結(jié)果：1、生源禪寧A對腸I/R損傷的保護作用及機制研究。(1)與假手術(shù)相比,I/R組：小腸炎細胞浸潤,絨毛排列紊亂,粘膜及粘膜下見水腫、出血。肝細胞索紊亂,中央靜脈及匯管區(qū)小血管瘀血、炎細胞浸潤,肝血竇擴張、瘀血。肺泡嚴重充血,炎性細胞浸潤,肺泡壁增厚,透明膜形成。腎小管明顯擴張,上皮細胞腫脹,腎小球及球后毛細血管擴張,見紅細胞滲出和炎細胞浸潤,腎小球萎縮。腸肝肺腎組織病理學評分均升高(P0.01,P0.01,P0.05,P0.05)；ALT、AST；BALFP水平；BUN和Cr顯著升高(P0.05)。血清TNF-α、IL-6;腸壞死性凋亡(RIP3、MLKL增加和Caspase-8降低)水平升高(P0.05,P0.05；P0.05,P0.05,P0.01)。腸FIAF mRNA和蛋白表達明顯升高；PPARα和PPARγ蛋白表達顯著升高；而PPARβ蛋白水平則降低(P0.05,P0.01；P0.05)。(2)與I/R組相比,BCA預(yù)處理組：小腸粘膜充血、間質(zhì)出血減輕：粘膜缺損、斷裂改善,腺體結(jié)構(gòu)清楚：肝臟充血、水腫減輕,炎細胞減少。肺泡充血、炎細胞浸潤減輕,未見透明膜,肺泡壁略厚。腎小管排列正常,輕度腫脹,腎小球腫脹破裂不明顯,偶見少量破裂紅細胞。腸肝肺腎組織病理學評分均降低(P0.05)。ALT、AST：BALFP水平；血BUN和Cr水平均降低(P0.05)。TNF-α、IL-6、小腸壞死性凋亡(RIP3、MLKL降低；Caspase-8升高)改善(P0.05)。腸FIAF mRNA和蛋白、PPARα和PPARγ水平進一步升高(P0.05)；而PPARβ蛋白水平則無明顯升高(P0.05)。2、BCA對Caco-2細胞H/R損傷的保護作用及其機制研究(1)、BCA通過PPARα和PPARγ誘導(dǎo)FIAF mRNA表達(P0.05)。(2)、Caco-2細胞缺氧1h后,FIAF蛋白和mRNA在16h內(nèi)呈現(xiàn)時間依賴性增高(P0.05)。(3)、H/R刺激使Caco-2細胞出現(xiàn)炎癥反應(yīng)和壞死性凋亡(P0.01)；BCA劑量依賴性的抑制炎癥反應(yīng)和壞死性凋亡(P0.05)。(4)、BCA能夠使FIAF蛋白和mRNA在H/R刺激后應(yīng)激性增高的基礎(chǔ)上進一步增高(P0.05)。(5)、FIAF在BCA干預(yù)保護H/R刺激的Caco-2細胞中是必不可少的(P0.01)。結(jié)論：1、BCA可以保護腸I/R導(dǎo)致的多器官損傷。2、BCA誘導(dǎo)FIAF的表達是通過活化PPARα和PPARβ發(fā)揮作用的。3、BCA可以通過上調(diào)FIAF蛋白和mRNA的表達,抑制腸上皮細胞壞死性凋亡,進而發(fā)揮對腸I/R多器官損傷的保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R574
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本文編號：1991751