本文選題：幽門(mén)螺桿菌 + 胃黏膜上皮　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景和目的： 胃黏膜上皮與其周?chē)h(huán)境(微生物、食物等)的相互作用-生物界面在促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和抵抗外界致病因素侵襲等方面發(fā)揮重要作用。其中,幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori, H.pylori)與胃黏膜上皮黏附構(gòu)成的H.pylori-胃黏膜上皮生物界面(H.pylori-gastric mucosal epithelium biointerface, H.pylori-GME biointerface)對(duì)探究H.pylori感染胃黏膜上皮的機(jī)制以及預(yù)防和治療H.pylori感染引起的胃腸道疾病至關(guān)重要。 據(jù)臨床病理學(xué)研究表明：當(dāng)H.pylori侵入胃黏膜后,大約21%的H.pylori與胃黏膜上皮細(xì)胞直接接觸。通過(guò)經(jīng)典的分子生物學(xué)手段,我們發(fā)現(xiàn)H.pylori通過(guò)菌體外膜蛋白(Outer membrane proteins, OMPs)與胃黏膜上皮細(xì)胞表面相應(yīng)的受體特異性結(jié)合,從而與胃黏膜上皮形成穩(wěn)定黏附。例如,BabA和SabA是兩種常見(jiàn)的黏附素,它們分別通過(guò)特異性地識(shí)別Lewisb和唾液酸化的Lewis"受體促進(jìn)H.pylori的穩(wěn)定黏附并引起組織炎癥反應(yīng)。CagL蛋白表達(dá)陽(yáng)性的H.pylori通過(guò)與胃黏膜上皮細(xì)胞表面的integrin β1特異性結(jié)合,從而啟動(dòng)Ⅳ型分泌系統(tǒng)將細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(Cytotoxin-associated gene A protein, CagA)轉(zhuǎn)移到感染的胃黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)并引起細(xì)胞功能異常。其它黏附素如,HopZ, AlpA/A1pB和OipA也參與黏附過(guò)程,并作為免疫靶點(diǎn)用于抗H.pylori疫苗的研制。但是由于H.pylorri-GME生物界面的復(fù)雜性,其它表面因素也可能影響H.pylori的黏附行為。 通過(guò)研究生物界面的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn),生物界面通過(guò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、化學(xué)成分與黏彈性圖案,使其與蛋白質(zhì)在納米尺度、細(xì)胞和組織在微米尺度上匹配,從而形成特定的生物醫(yī)學(xué)功能。生物小分子(化學(xué)成分)是構(gòu)成人體內(nèi)各組織結(jié)構(gòu)的最小單位,它決定不同組織的性質(zhì)。并且依次通過(guò)納米水平、微米水平的自組裝,從而形成特殊的微-納米復(fù)合結(jié)構(gòu)(拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)),后者又表現(xiàn)出獨(dú)特的力學(xué)性質(zhì)(黏彈性圖案),最終影響各組織器官的宏觀功能。這就是微尺度構(gòu)建-功能-力學(xué)耦合機(jī)制。因此,除了關(guān)鍵分子蛋白的相互作用,H.pylori-GME生物界面的微尺度形貌和力學(xué)因素也影響H.pylori的黏附行為。但由于研究方法和技術(shù)手段的限制,目前此方面的研究還很少。 本文利用納米加工技術(shù)仿生制備了H.pylori-GME生物界面微尺度形貌。并通過(guò)細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)在體外研究H.pylori-GME生物界面微尺度形貌對(duì)細(xì)菌黏附行為的影響。另一方面,借助剛度可控的高分子材料仿生模擬不同胃黏膜上皮細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)環(huán)境,并利用力學(xué)表征手段以及分子生物學(xué)方法探究其對(duì)H.pylori-GME生物界面黏附行為的作用。從而補(bǔ)充H.pylori與胃黏膜上皮的黏附機(jī)制,為臨床診斷和治療H.pylori感染引起的胃腸道疾病提供新思路。 方法： 首先,我們參考H.pylori感染相關(guān)的臨床病理研究確定不同病理階段胃黏膜上皮微尺度形貌變化的參數(shù)。再利用反應(yīng)離子刻蝕(Reactive ion etching, RIE)技術(shù),在體外制備H.pylori-GME生物界面特征形貌的仿生結(jié)構(gòu)。根據(jù)不同種屬細(xì)菌(幽門(mén)螺桿菌、大腸桿菌和金色葡萄球菌)黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合定量的形貌學(xué)分析闡述H.pylori-GME生物界面形貌影響細(xì)菌黏附的規(guī)律。 然后,我們利用聚丙烯酰胺(Polyacrylamide, PAAm)水凝膠體系,模擬胃黏膜上皮細(xì)胞外基質(zhì)的不同力學(xué)環(huán)境。從而研究剛度對(duì)H.pylori與胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)黏附的影響。并利用原子力顯微術(shù)(Atomic force microscopy, AFM)與分子生物學(xué)手段對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行初步探討。 最后,基于環(huán)境掃描電子顯微鏡(Environmental scanning electronic microscope, ESEM)在生物樣本成像方面的優(yōu)勢(shì),對(duì)利用不同形貌的金納米顆粒定位A549細(xì)胞表面蛋白的方法進(jìn)行探索,為進(jìn)一步研究力學(xué)因素影響H.pylori與胃黏膜上皮細(xì)胞黏附的分子機(jī)制提供新方法。 本文數(shù)據(jù)均利用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析,其中連續(xù)型變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來(lái)表示,非連續(xù)型變量采用中位數(shù)和四分位數(shù)(M(Q1；Q2))。并且利用相應(yīng)的參數(shù)檢驗(yàn)方法對(duì)連續(xù)性變量的進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；利用相應(yīng)的非參數(shù)方法對(duì)非連續(xù)型變量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1. H.pylori-GME生物界面微尺度形貌仿生結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)菌黏附的影響 1.1H.pylori-GME生物界面微尺度形貌的仿生結(jié)構(gòu)參數(shù)和物理性質(zhì) 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,正常胃黏膜上皮細(xì)胞表面形貌是由一定間距、粗細(xì)均勻的微絨毛陣列構(gòu)成。其中微絨毛直徑大約為200nm；高度大約為500nm。絨毛間距大約為200nm。并且H.pylori感染導(dǎo)致其變短和消失,以及腸上皮化生的出現(xiàn)。由此可見(jiàn),H.pylori-GME生物界面微尺度形貌就是高度和間距逐漸變化的微絨毛陣列。通過(guò)RIE對(duì)聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)的精細(xì)加工,我們?cè)隗w外成功地仿生了H.pylori-GME生物界面特殊形貌,即柱高度(200nm、700nm和1200nm)和間距(50nm、200nm和400nm)逐漸變化的直徑約為250nm的納米柱陣列。 通過(guò)AFM和接觸角測(cè)量?jī)x表征,我們獲得了PET納米柱結(jié)構(gòu)以及PET平面結(jié)構(gòu)的表面物理性質(zhì)參數(shù),且以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。與PET平面結(jié)構(gòu)相比(Ra、Rq和WCA的95%可信區(qū)間分別為1.8-3.6；2.3-4.4；100.3-117.4),PET納米柱陣列相對(duì)粗糙且親水(Ra=17.4～257.9；Rq=21.1～333.4；WCA=100.3～117.4)。通過(guò)析因資料的方差分析,結(jié)果表明PET納米柱陣列的高度和柱間距影響了結(jié)構(gòu)表面的粗糙度和親疏水性質(zhì)。一方面,柱高度對(duì)PET納米柱陣列粗糙度的影響有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Ra值F=143.480,P0.001；Rq值F=182.213,P0.001)。并且結(jié)合多組間比較檢驗(yàn)(Bonferroni法或DunnettT3法)發(fā)現(xiàn),在柱間距50nm的納米柱陣列中,隨著高度增加粗糙度有增加的趨勢(shì),但無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Ra值P=0.209；Rq值P=0.393)；柱間距為200nm和400nm的納米柱陣列中,隨著高度增加粗糙度逐漸增加,并且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Ra值P=0.014,Rq值P=0.063;Ra值P0.001,Rq值P0.001)。另外,柱間距對(duì)PET納米柱陣列粗糙度的影響有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Ra值F=887.891,P0.001；Rq值F=928.372,P0.001)。隨著柱間距增加,納米柱陣列的粗糙度也逐漸增加(均P0.050)。另一方面,柱間距對(duì)PET納米柱陣列WCA的影響有顯著差異(F=45.894,P0.001)。在高度為200nm的納米柱陣列中,不同柱間距的納米柱陣列的WCA有無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.548)。在高度為700nm和1000nm的納米柱陣列中,隨間距增加WCA也逐漸增加,且具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.004；P0.001)。另外,高度對(duì)PET納米柱陣列WCA的影響有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=139.532,P0.001)。隨著高度增加,納米柱陣列的WCA也逐漸增加(均P0.001)。 1.2H.pylori-GME生物界面微尺度形貌的仿生結(jié)構(gòu)細(xì)菌黏附的影響 通過(guò)細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),柱高度和間距規(guī)律變化的仿生微絨毛結(jié)構(gòu)影響了細(xì)菌黏附的數(shù)量。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。利用析因資料的方差分析發(fā)現(xiàn),無(wú)論細(xì)菌的種屬和形貌,柱高度對(duì)細(xì)菌黏附的影響無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(H.pylori43504F=0.151, P=0.860; S.aureus6538F=1.508P=0.350; E.coliBL21F=0.019P=0.982)。而納米柱間距對(duì)細(xì)菌黏附數(shù)量的影響都有相似的規(guī)律(H.pylori43504F=480.631, P0.001; S.aureus6538F=879.873, P0.001; E.coli BL21F=250.481, P0.001).去除柱高度因素,再次研究三種細(xì)菌在不同PET機(jī)構(gòu)上的黏附規(guī)律。通過(guò)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析檢測(cè)表明：三種細(xì)菌4組間方差不齊(均P≤0.001),并且不同PET結(jié)構(gòu)對(duì)三種細(xì)菌的黏附都具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(H.pylori43504F=498.090, P 0.001; S.aureus6538F=609.183, P 0.001; E.coli BL21F=178.220, P 0.001)。利用Dunnett's T3方法進(jìn)一步進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn),與PET平面結(jié)構(gòu)(control)相比,柱間距為50nm的納米柱陣列促進(jìn)了H.pylori43504和S.aureus6538的黏附(104.6±12.7vs69.7±9.3, P0.001;190.4±21.8vs134.0±11.7, P0.001)但并未影響E.coli BL21的黏附(46.8±12.5vs51.7±14.9,P=0.830)；與柱間距50nm的納米柱陣列相比,增大的柱間距(200nm和400nm)抑制了H.pylori43504和E.coli Bl21的黏附(H.pylori4350458.4±7.6和45.3±6.6vs104.6±12.7,均P0.001;S.aureus653854.9±12.5和86.9±12.5vs190.4±21.8,均P0.001；E.coli BL2126.9±7.1和5.5±3.7vs46.8±12.5,均P0.001)。但與200nm柱間距相比,400nm柱間距反而促進(jìn)了S.aureus6538的黏附(54.9±12.5vs86.9±12.5,P0.001)。此外,增大的柱間距對(duì)細(xì)菌表面附屬器和細(xì)胞外多聚物分泌的也有一定影響。 利用CellTool軟件對(duì)不同間距的PET陣列和平面結(jié)構(gòu)上的黏附細(xì)菌進(jìn)行形貌分析,我們發(fā)現(xiàn)納米柱陣列上細(xì)菌的形態(tài)變異的參數(shù),結(jié)果以中位數(shù)和四分位數(shù)表示。通過(guò)采用Kruskal-Wallis H非參數(shù)檢測(cè)法分析發(fā)現(xiàn),納米柱陣列的間距影響有顯著差異(E.coli BL21X2=26.428, P 0.001; S.aureus6538X2=73.002, P0.001; H.pylori43504X2=20.257, P0.001)。并且形態(tài)變化與細(xì)菌種屬直接關(guān)系。進(jìn)一步比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行任意兩組間比較得知,Eeoli的主要形貌變異模型只有一種,即中心軸長(zhǎng)度的變異。與平面對(duì)照組相比,納米柱陣列上的E.coli長(zhǎng)度相對(duì)較短(P0.001),且隨著柱間距增大有減少的趨勢(shì)。S.aureus主要形貌變異模型有三種,即直徑變異和兩種次要的局部邊緣曲率變異。由于直徑變異占主要部分,且其他兩種變異也可由直徑變異部分表述,所以選擇細(xì)菌的平均直徑為評(píng)估其主要形貌變異的參數(shù)。與平面對(duì)照組相比,納米柱陣列上的S.aureus平均直徑相對(duì)較大(均P0.001),且隨著柱間距增大有減少的趨勢(shì)。H.pylori的主要變異模型有四種,即中心軸長(zhǎng)度變異和三種邊緣曲率變異。因此,中心軸長(zhǎng)度和邊緣曲率都可應(yīng)作為形貌變異參數(shù)。為了方便表述,用邊緣曲率與中心軸長(zhǎng)度的比值(RCL)來(lái)表示H.pylori的主要形貌變異。與其它結(jié)構(gòu)相比,H.pylori43504在400nm柱間距的納米柱陣列上形態(tài)更加彎曲(均P≤0.002),且隨著柱間距增大有減少的趨勢(shì)。 2. H.pylori-GME生物界面剛度對(duì)H.pylori的影響 2.1不同剛度PAAm水凝膠基底對(duì)H.pylori與GES-1細(xì)胞黏附的影響 通過(guò)ESEM電鏡表征,我們可以定量不同剛度PAAm水凝膠基底上GES-1細(xì)胞黏附H.pylori的情況。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。通過(guò)與細(xì)胞表面微絨毛直接接觸而利于其黏附,并且傾向黏附在細(xì)胞質(zhì)區(qū)邊緣處。根據(jù)經(jīng)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析檢驗(yàn)結(jié)果表明,不同剛度的PAAm水凝膠基底上單個(gè)GES-1細(xì)胞表面黏附的H.pylori數(shù)量有顯著差異(F=55.880,P0.001)。采用Bonferroni法進(jìn)行任意兩組間比較發(fā)現(xiàn)：與0.7kPa PAAm水凝膠基底相比,增大的基底剛度促進(jìn)了H.pylori與GES-1細(xì)胞的黏附(均P0.001)。其中,在3.8kPa PAAm水凝膠基底上,單個(gè)GES-1細(xì)胞表面黏附的H.pylori數(shù)量最多(17.6±4.4,均P≤0.005)。并且8.4kPa和21.5kPa PAAm水凝膠基底上的單個(gè)GES-1細(xì)胞表面黏附的H.pylori數(shù)量無(wú)顯著差異(14.2±3.6vs14.3±4.0,P=1.000)。但H.pylori在Ⅰ型膠原蛋白修飾PAAm水凝膠基底黏附能力差,數(shù)量少。且不同剛度基底上H.pylori黏附數(shù)量無(wú)明顯差異(X2=1.738,P=0.628)。2.2不同剛度PAAm水凝膠基底對(duì)GES-1細(xì)胞形態(tài)和物理性質(zhì)的影響 隨著基底剛度的增加,GES-1細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變。在0.7kPa基底上,細(xì)胞很難鋪展,呈類(lèi)球形,細(xì)胞成團(tuán)聚集。并且細(xì)胞表面有較多短而鈍的微絨毛。當(dāng)基底剛度達(dá)到8.4kPa時(shí),細(xì)胞已完全鋪展,細(xì)胞表面有較少長(zhǎng)而細(xì)的微絨毛,并且細(xì)胞邊緣有較多絲狀偽足。 利用AFM我們得到GES-1細(xì)胞表面物理參數(shù),結(jié)果以中位數(shù)和四分位數(shù)表示。通過(guò)Kruskal-Wallis H非參數(shù)檢測(cè)法檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不同剛度PAAm水凝膠基底上的GES-1細(xì)胞微區(qū)剛度有顯著差異(細(xì)胞質(zhì)邊緣區(qū)X2=47.025,P0.001；細(xì)胞核區(qū)X2=14.075,P=0.003)。進(jìn)一步Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行任意兩組間比較發(fā)現(xiàn)：隨著基底剛度增加,細(xì)胞微區(qū)剛度也逐漸增加。但是在8.4kPa和21.5kPa剛度基底上,GES-1細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)邊緣區(qū)剛度無(wú)差別(P=0.193),但核區(qū)剛度有顯著差別(P=0.003)。并且在各組剛度基底上,細(xì)胞質(zhì)邊緣區(qū)的剛度都要大于核區(qū)(t=3.762,P0.001；t=2.680,P=0.007；t=4.008,P0.001:,=5.199,P0.001).另外,不同剛度PAAm水凝膠基底上的GES-1細(xì)胞微區(qū)與AFM探針的黏附功有顯著差異(細(xì)胞質(zhì)邊緣區(qū)X2=52.163,P0.001；細(xì)胞核區(qū)X2=46.775,P0.001)。并且通過(guò)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：除在3.8kPa剛度PAAm水凝膠基底上細(xì)胞微區(qū)間黏附功無(wú)顯著差異(t=0.355,P=0.723)外,細(xì)胞質(zhì)邊緣區(qū)的黏附功都要大于核區(qū)(t=2.584,P=0.010；t=3.895,P0.001;t=5.470,P0.001)。 2.3不同剛度PAAm水凝膠基底對(duì)GES-1細(xì)胞integrin β1蛋白表達(dá)的影響 通過(guò)western bolt和免疫熒光顯微術(shù)半定量的檢測(cè)GES-1細(xì)胞integrin β1蛋白表達(dá),結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。經(jīng)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析檢驗(yàn)結(jié)果表明,不同剛度PAAm水凝膠上GES-1細(xì)胞integrin β1蛋白的表達(dá)有明顯差異(F=250.372,P0.001)。由于4組PAAm水凝膠基底間方差不齊(P=0.038),因此采用Dunnett T3法進(jìn)行多組間比較,結(jié)果表明與0.7kPa剛度PAAm水凝膠上GSE-1細(xì)胞integrin β1蛋白表達(dá)水平(0.7±0.0)相比,其它剛度PAAm水凝膠上GSE-1細(xì)胞integrin β1蛋白表達(dá)增加(均P0.050)。并且3.8kPa剛度PAAm水凝膠上GSE-1細(xì)胞integrin β1蛋白表達(dá)水平最高(2.3±0.2,均P0.050),但與8.4kPa剛度PAAm水凝膠上GSE-1細(xì)胞integrin β1蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.217)。 3.生物界面表面多蛋白分子標(biāo)記技術(shù)探索 通過(guò)修飾特異性抗體的不同形貌的金納米顆粒(金納米棒和金八面體)對(duì)A549細(xì)胞表面insulin receptor和caveolin-1蛋白標(biāo)記發(fā)現(xiàn)：相比于非特異性吸附作用,通過(guò)特異性結(jié)合可以識(shí)別細(xì)胞膜表面的insulin receptor和caveolin-1蛋白,并且發(fā)現(xiàn)的兩者分布具有一定重合。 結(jié)論： 1. H.pylori-GME生物界面特征形貌是由高度和間距逐漸變化的微絨毛陣列構(gòu)成。隨著微絨毛間距和高度的增加,界面表面粗糙度增加,并且趨于疏水。增大的微絨毛間距抑制了細(xì)菌的黏附,并且對(duì)特殊形態(tài)的細(xì)菌進(jìn)行篩選。 2. H.pylori-GME生物界面的力學(xué)性質(zhì)和關(guān)鍵蛋白的表達(dá)受胃黏膜上皮細(xì)胞外基質(zhì)剛度的影響。胃黏膜上皮細(xì)胞外基質(zhì)剛度通過(guò)增加胃黏膜上皮細(xì)胞表面integrin β1蛋白的表達(dá),而不是直接通過(guò)增加的細(xì)胞表面剛度促進(jìn)H.pylori與胃黏膜上皮細(xì)胞的黏附。 3.基于不同形貌金納米顆粒的生物界面表面蛋白分子標(biāo)記技術(shù)可作為研究生物界面多蛋白相互作用的表征方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R573

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1902550