本文選題：非酒精性脂肪性肝纖維化 + miRNAs　； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：非酒精性脂肪性肝�。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確因素所致的以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為主要特征的臨床病理綜合征，是與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的獲得性代謝應(yīng)激性肝損傷。NAFLD疾病譜包括單純性脂肪肝（simple fattyliver，SFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纖維化及相關(guān)肝硬化。其中，NASH為該病進(jìn)展的重要病理階段，以肝細(xì)胞脂肪變伴有壞死性炎癥和/或纖維化為主要特征，進(jìn)一步可進(jìn)展為肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌。 近年來，隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD的發(fā)病率逐年增高，并趨于年輕化。NAFLD患病率為歐美及澳大利亞等發(fā)達(dá)國家慢性肝病的首位，也是肝酶學(xué)異常的首要病因，普通人群患病率高達(dá)20%～40%。亞太地區(qū)NAFLD患病率為12%～24%，其中1/3～1/2為NASH，后者有15%～25%在10年內(nèi)可進(jìn)展為肝硬化，而非酒精性脂肪性肝硬化患者原發(fā)性肝細(xì)胞癌、肝功能衰竭的發(fā)生率高達(dá)30%～40%。近年來我國NAFLD患病率逐年上升，城市人口患病率達(dá)15.35%～31.3%。據(jù)2010年城市人口健康調(diào)查結(jié)果，男性脂肪肝患病率為19%，女性為15%，分別為危害健康第一位和第九位的危險(xiǎn)因素。南月敏等對(duì)健康體檢的綜合醫(yī)院醫(yī)務(wù)工作者連續(xù)隨訪5年，患病率達(dá)31.6%。朗振為等對(duì)不明原因肝炎病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)NASH占15.5%。NAFLD已成為危害人類健康和生活質(zhì)量的主要肝臟疾病之一。非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化為NAFLD進(jìn)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是，目前非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，亦缺乏準(zhǔn)確判斷病情的指標(biāo)及特異有效的防治措施，對(duì)于非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病機(jī)制、基因診斷標(biāo)志及治療新靶點(diǎn)的探索十分必要和迫切。 MicroRNAs（miRNAs）作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子在肝臟的生成、分化及代謝過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Sanyal等發(fā)現(xiàn)在NASH患者肝組織中miR-34a和miR-146b表達(dá)上調(diào)、miR-122下調(diào)。其中，miR-122可通過負(fù)性調(diào)控固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（Sterol ResponsiveElement Binding Protein-1c， SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（fatty acidsynthetase，F(xiàn)AS）和HMG-CoA還原酶（HMG CoA reductase，HMGCR）的表達(dá)，參與肝細(xì)胞脂肪酸的生物合成過程。而miR-33a與miR-33b也可通過調(diào)控固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（Sterol Responsive Element BindingProtein，SREBP）轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，參與膽固醇和脂肪代謝的調(diào)控。miR-34a通過抑制�；o酶A合成酶長鏈家族成員1（acyl-CoA synthetaselong-chain family member1，ACSL1）的表達(dá)、去乙�；�-1的表達(dá)調(diào)控腺苷一磷酸激酶（AMP kinase）和HMG-CoA還原酶的脫磷酸化，參與膽固醇的生物合成過程。另外，miR-467b通過負(fù)性調(diào)控其靶蛋白肝臟脂蛋白酶表達(dá)，減少游離脂肪酸的生成，參與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）導(dǎo)致脂質(zhì)沉積過程的調(diào)控。miR-103與miR-107可通過調(diào)控其靶基因胰島素受體小窩蛋白-1（Caveolin-1，，CAV1），調(diào)節(jié)胰島素敏感性、維持血糖平衡。作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，特定的miRNAs可能參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展，但其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 本研究首先應(yīng)用膽堿-蛋氨酸缺乏（methionine and choline deficience，MCD）飲食8周建立非酒精性脂肪性肝纖維化動(dòng)物模型，應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)小鼠肝組織中miRNAs表達(dá)譜的變化；采用實(shí)時(shí)定量PCR方法驗(yàn)證各組小鼠肝組織中差異表達(dá)的miRNAs，篩選與非酒精性脂肪性肝纖維化有關(guān)表達(dá)變化最明顯的miRNA；通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，進(jìn)行功能分類和信號(hào)通路預(yù)測(cè)；采用實(shí)時(shí)定量PCR及westernblot方法檢測(cè)miRNA靶基因及靶蛋白在非酒精性肝纖維化小鼠肝組織中的表達(dá)變化。構(gòu)建含有目標(biāo)miRNA靶基因3′-UTR的報(bào)告載體，采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)（Luciferase Reporter Assay）進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA對(duì)其靶基因的調(diào)控作用。靶向調(diào)控LX-2細(xì)胞中關(guān)鍵miRNA表達(dá)，觀察非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病關(guān)鍵基因表達(dá)變化，深入闡明miRNAs在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病過程中的作用、其作用的靶基因及主導(dǎo)分子信號(hào)通路，為非酒精性脂肪性肝纖維化的臨床防治提供新的靶點(diǎn)及依據(jù)。 第一部分：非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠肝組織中異常表達(dá)miRNAs的篩選與驗(yàn)證 目的：篩選非酒精性脂肪性肝纖維化形成過程中異常表達(dá)的miRNAs。 方法：采用MCD飲食喂養(yǎng)6~7周齡清潔級(jí)健康雄性C57BL/6J小鼠8周，建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型，以膽堿蛋氨酸充足飼料喂養(yǎng)對(duì)照組小鼠。酶聯(lián)免疫法測(cè)定小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineaminotransferase， ALT）及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartateaminotransferase，AST）的水平；HE及Masson染色觀察肝臟組織脂肪變性、炎癥活動(dòng)及纖維化程度，并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分；應(yīng)用Qiagen公司的MiRNeasy Mini Kit試劑盒提取部分新鮮肝臟組織的總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA質(zhì)量，1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定RNA純度，采用AffymetrixmiRNA基因表達(dá)譜芯片GeneChip miRNA2.0Array進(jìn)行雜交，進(jìn)行miRNAs基因芯片檢測(cè)，篩查在非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠肝組織中異常表達(dá)的miRNAs并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。 結(jié)果： 1.一般情況：造模過程中，對(duì)照組小鼠活潑，毛發(fā)有光澤，體重逐漸增加；MCD模型組小鼠精神萎靡，少動(dòng)，毛發(fā)紊亂、無光澤，攝食明顯減少，體重增長緩慢，隨著時(shí)間推移，模型組小鼠出現(xiàn)被毛脫落現(xiàn)象。 2.肝指數(shù)變化：MCD模型組小鼠體重顯著低于對(duì)照組（P 0.05），肝濕重較對(duì)照組無明顯變化（P0.05），肝指數(shù)（肝濕重/體重×100%）較對(duì)照組明顯升高（P 0.05）。 3.各組小鼠血生化指標(biāo)的結(jié)果：MCD組血清中ALT及AST的水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）。 4.各組小鼠肝組織HE及Masson染色的結(jié)果：MCD組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)重度脂肪變性，并伴點(diǎn)狀和灶狀壞死、炎性細(xì)胞浸潤、匯管區(qū)纖維組織增生及竇周纖維化等。 5. miRNAs芯片結(jié)果：與對(duì)照組相比，MCD模型組有47個(gè)差異表達(dá)的miRNAs（P 0.05），其中15個(gè)變化在2倍之上。mmu-let-7i、mmu-mir-155、 mmu-mir-199a-5p、 hsa-mir-34a、 mmu-mir-221、mmu-mir-200c、 mmu-mir-297c、 mmu-mir-713、 mmu-mir-190b、mmu-mir-678，10個(gè)miRNAs在MCD模型組的肝臟組織中表達(dá)明顯上調(diào)；mmu-mir-122、mmu-mir-103、mmu-mir-146、mmu-mir-101a、mmu-mir-466j，5個(gè)miRNAs在MCD模型組的肝臟組織中表達(dá)明顯下調(diào)。 6.綜合本實(shí)驗(yàn)基因芯片結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選擇miR-122、miR-221及miR-199a-5p進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，MCD組小鼠肝組織中miR-199a-5p的表達(dá)明顯增高、miR-122明顯降低（P 0.05）。 結(jié)論： 1在MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪性肝纖維化動(dòng)物模型中，肝組織miRNAs表達(dá)譜明顯改變，表明差異表達(dá)的miRNAs參與非酒精性脂肪性肝炎／肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。 2miR-199a-5p可能為非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控基因之一。第二部分：miR-199a-5p生物信息學(xué)分析及靶基因驗(yàn)證 目的：探討miR-199a-5p在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病中可能的作用及其潛在的作用靶點(diǎn)。 方法：動(dòng)物分組及標(biāo)本取得同第一部分。應(yīng)用TargetScan6.2、miRanda及PITA軟件共同預(yù)測(cè)miR-199a-5p的靶基因，應(yīng)用DAVID軟件分析miR-199a-5p可能的生物學(xué)功能及參與調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Western blot法分析在非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠肝組織中miR-199a-5p靶基因mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化情況。 結(jié)果： 1.生物信息學(xué)分析結(jié)果：GO分析結(jié)果顯示，miR-199a-5p參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物組成、絲蘇氨酸蛋白激酶活化等多種生物學(xué)調(diào)控；KEGG分析顯示，miR-199a-5p參與胰島素信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等多條通路的調(diào)控。 2. miR-199a-5p的靶基因預(yù)測(cè)：應(yīng)用三種miroRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件（TargetScan、PITA和miRanda）共同預(yù)測(cè)miR-199a-5p的靶基因，得到26個(gè)與miR-199a-5p相關(guān)的基因。 3.各組小鼠肝臟組織中miR-199a-5p靶基因核受體共抑制劑1（nuclear receptor corepressor，NCOR1)的表達(dá)情況：與對(duì)照組相比，MCD組肝組織中NCOR1蛋白的表達(dá)明顯減少（p 0.05），與miR-199a-5p的表達(dá)負(fù)相關(guān)；模型組與對(duì)照組肝組織NCOR1mRNA表達(dá)無明顯差異。 結(jié)論： 1生物信息學(xué)分析結(jié)果示，miR-199a-5p參與胰島素信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等多條與非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)生發(fā)展相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控。 2在MCD飲食誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，miR-199a-5p可能通過調(diào)控NCOR1蛋白的表達(dá)參與疾病的發(fā)生與進(jìn)展。 第三部分：miR-199a-5p與其靶基因NCOR1的相互作用機(jī)制 目的：驗(yàn)證miR-199a-5p與NCOR13′-UTR靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。 方法：根據(jù)Gene Bank公布的人NCOR1基因3′-UTR序列設(shè)計(jì)含有miR-199a-5p結(jié)合位點(diǎn)的NCOR13′-UTR PCR引物，并在引物中加入Not I和Xho I兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增的NCOR13′-UTR序列插入攜帶螢火蟲熒光與海腎熒光雙熒光報(bào)告基因的psiCHECKTM-2質(zhì)粒的Xho I和Not I位點(diǎn)之間，構(gòu)建NCOR13′-UTR-luciferase報(bào)告載體，將NCOR13′-UTR-luciferase報(bào)告載體與pre-miR-199a-5p共同轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，48h后檢測(cè)熒光強(qiáng)度，并計(jì)算螢火蟲熒光與海腎熒光的比值。分析miR-199a-5p對(duì)NCOR1的靶向調(diào)控作用。 結(jié)果： 1.查詢“Ensembl Mouse database”，得到全長2202bp的NCOR13′-UTR序列，其中，在NCOR13′-UTR的790bp～796bp處存在可能與miR-199a-5p結(jié)合的位點(diǎn)。 2.從血液中提取基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳顯示出一條約2000bp特異性片段，實(shí)驗(yàn)與預(yù)期結(jié)果相符。重組質(zhì)粒p3′UTR-NCOR1經(jīng)上海生工進(jìn)一步測(cè)序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建正確。 3.將構(gòu)建的p3′UTR-NCOR1質(zhì)粒與pre-miR-199a-5p或陰性對(duì)照序列共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，48h后檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-199a-5p可以直接作用于NCOR13′-UTR序列，并可抑制熒光素酶活性。。 結(jié)論：miR-199a-5p可靶向作用于NCOR13′-UTR，負(fù)性調(diào)控NCOR1的表達(dá)。第四部分：miR-199a-5p靶向調(diào)控對(duì)LX-2細(xì)胞活力與功能的影響 目的：靶向調(diào)控LX-2細(xì)胞中miR-199a-5p表達(dá)，觀察非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病關(guān)鍵基因表達(dá)變化，深入闡明miRNAs在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病過程中的作用、其作用的靶基因及主導(dǎo)分子信號(hào)通路，為非酒精性脂肪性肝纖維化的臨床防治提供新的靶點(diǎn)及科學(xué)依據(jù)。 方法：應(yīng)用人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%左右時(shí)，用不同濃度miR-199a-5p的模擬物及抑制劑轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，采用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞活力，選擇合適的轉(zhuǎn)染濃度。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western-blot法分析miR-199a-5p及其靶基因NCOR1mRNA及蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)應(yīng)用Western-blot方法觀察miR-199a-5p對(duì)非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病關(guān)鍵因子的影響。 結(jié)果： 1. MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染不同濃度的對(duì)照序列對(duì)LX-2細(xì)胞活力無明顯影響；轉(zhuǎn)染100nM及150nM的miR-199a-5p模擬物后，LX-2細(xì)胞活力明顯降低，而轉(zhuǎn)染50nM的模擬物，則無明顯變化；轉(zhuǎn)染100nM及150nM的miR-199a-5p抑制劑后，LX-2細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，而50nM的miRNA抑制劑則對(duì)細(xì)胞活力無明顯影響； 2.各轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組LX-2細(xì)胞相比，miR-199a-5p的表達(dá)量有不同程度改變，miR-199a-5p靶基因NCOR1mRNA的表達(dá)量則無明顯變化。與未轉(zhuǎn)染組比較，NC組miR-199a-5p的表達(dá)量無明顯變化，Mimic組miR-199a-5p的表達(dá)量顯著增高（P 0.01），Inhibitor組miR-199a-5p表達(dá)量明顯降低（P 0.05）； 3.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-199a-5p靶蛋白NCOR1及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）蛋白的表達(dá)量有不同程度改變，與未轉(zhuǎn)染組比較，NC組NCOR1和PPARγ蛋白的表達(dá)量均無明顯變化，Mimic組NCOR1蛋白的表達(dá)量顯著降低，PPARγ蛋白的表達(dá)量明顯增高（P 0.05），Inhibitor組NCOR1蛋白表達(dá)量明顯增高，PPARγ蛋白的表達(dá)量則降低（P 0.05）。PPARγ蛋白與轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞中NCOR1蛋白的表達(dá)變化相反； 4.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞肝纖維化相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforminggrowth factor beta，TGFβ1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達(dá)量有不同程度改變，與未轉(zhuǎn)染組比較，NC組TGF-β1及α-SMA蛋白的表達(dá)量無明顯變化，Mimic組TGF-β1及α-SMA蛋白的表達(dá)量顯著降低（P 0.05），Inhibitor組TGF-β1及α-SMA蛋白表達(dá)量明顯增高（P 0.05）。TGF-β1及α-SMA蛋白與轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞中NCOR1蛋白的表達(dá)變化一致。 結(jié)論： 1轉(zhuǎn)染miR-199a-5p模擬物或抑制劑可引起LX-2細(xì)胞活力的改變，提示miR-199a-5p可能通過影響HSC細(xì)胞增殖及活化參與非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)病過程。 2miR-199a-5p可能通過負(fù)性調(diào)控NCOR1蛋白表達(dá)影響PPARγ蛋白活性，參與肝星狀細(xì)胞的激活。 3靶向調(diào)控miR-199a-5p表達(dá)可阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生與進(jìn)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 南月敏;王蕾;李良霄;付娜;;非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J];河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年01期

2 南月敏;;非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代消化及介入診療;2009年03期

3 韋君;樊曉明;;microRNAs在肝臟中的作用[J];世界華人消化雜志;2012年01期

4 景花;宋沁馨;周國華;;MicroRNA定量檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J];遺傳;2010年01期

5 ;PPAR gamma inhibits growth of rat hepatic stellate cells and TGF beta-induced connective tissue growth factor expression[J];Acta Pharmacologica Sinica;2006年06期

6 Yves Deugnier;Bruno Turlin;;Pathology of hepatic iron overload[J];World Journal of Gastroenterology;2007年35期

本文編號(hào)：1881160