本文選題：白蛋白啟動(dòng)子 + 腺病毒載體　； 參考：《西南醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的:構(gòu)建攜帶小鼠、大鼠、人白蛋白啟動(dòng)子通用序列的腺病毒載體,研究其在三個(gè)種屬的肝臟來源細(xì)胞、非肝臟來源細(xì)胞及干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞樣細(xì)胞中對(duì)白蛋白的檢測(cè),為干細(xì)胞肝向分化狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供新的方法。方法:⑴.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:人肝癌細(xì)胞Hep G2、小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6培養(yǎng)基選用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。采用原位兩步膠原酶灌流法進(jìn)行大鼠原代肝細(xì)胞的分離及純化,獲得的原代肝細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行膠原-Matrigel三明治夾心培養(yǎng)。SD大鼠MSC生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)第6-8代大鼠BM-MSCs。取第4-6代小鼠BM-MSCs,采用C57BL/6小鼠MSC生長(zhǎng)培養(yǎng)基。所有細(xì)胞培養(yǎng)條件均為37℃,5%CO2,飽和濕度。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代,24小時(shí)后,細(xì)胞密度為50 70%轉(zhuǎn)染重組質(zhì)�；虿《尽＂�.構(gòu)建重組質(zhì)粒p DRIVE-SV40-Albp-Lac Z及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:根據(jù)(1)啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)白蛋白啟動(dòng)子長(zhǎng)1000bp,位于-700/+299;(2)表達(dá)載體容量;(3)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),從Gene Bank BLAST中獲得三段人白蛋白啟動(dòng)子片段,然后將這三段啟動(dòng)子片段送至漢恒生物分別制得轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒p DRIVE-SV40-Albp-Lac Z的三種GT100 E.coli,擴(kuò)增E.coli,提取質(zhì)粒,分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒DNA的濃度。三種重組質(zhì)粒脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Hepa1-6,顯微鏡觀察加入X-gal后各組細(xì)胞藍(lán)色沉淀的生成。利用Image-pro Plus 6.0軟件,人工計(jì)算藍(lán)染細(xì)胞比率。⑶.構(gòu)建SV40-Albp-Zs Green腺病毒載體并感染肝臟及非肝臟來源細(xì)胞:從上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hepa1-6試驗(yàn)中,獲得-173/+36(210bp,Fragment 3)為白蛋白啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性最高的片段。依據(jù)質(zhì)粒p DRIVE-SV40-Albp-Lac Z轉(zhuǎn)染Hepa1-6實(shí)驗(yàn)結(jié)果,SV40增強(qiáng)子與白蛋白啟動(dòng)子的連接可有效調(diào)控Lac Z基因的表達(dá),所以在構(gòu)建腺病毒載體時(shí)我們也采用SV40增強(qiáng)子與白蛋白啟動(dòng)子連接,以保證白蛋白啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。SV40增強(qiáng)子與白蛋白啟動(dòng)子連接片段(SV40-Albp)序列由漢恒生物提供,從Gene Bank中獲得Zs Green序列。按照引物設(shè)計(jì)的原則設(shè)計(jì)SV40-Albp及報(bào)告基因Zs Green引物,人工合成SV40-Albp片段及Zs Green。亞克隆至切除啟動(dòng)子的表達(dá)載體p HBAd-U6-CMV的Xba I/Mlu I酶切位點(diǎn)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α,篩選含有目的基因的表達(dá)質(zhì)粒p HBAd-SV40-Albp-Zs Green陽性克隆,經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定正確后,和骨架質(zhì)粒p HBAd-BHG脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝、擴(kuò)增、并檢測(cè)病毒滴度。SV40-Albp-Zs Green腺病毒載體感染肝臟及非肝臟來源細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡觀察Zs Green基因的表達(dá),并以CMV-GFP腺病毒載體作為陽性對(duì)照。同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞爬片,免疫熒光染色檢測(cè)各細(xì)胞ALB表達(dá)。⑷.SV40-Albp-Zs Green腺病毒載體感染肝向分化的小鼠BM-MSCs:采用兩步法誘導(dǎo)方案(第一步:20 ng/ml HGF+10 ng/ml b FGF+0.61g/ml NAM培養(yǎng)7天,第二步:20 ng/ml OSM+1umol/L DXM+50mg/ml ITS 14天)誘導(dǎo)小鼠BM-MSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化。21天后,SV40-Albp-Zs Green腺病毒載體感染肝向分化的細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡觀察Zs Green基因的表達(dá),并以CMV-GFP腺病毒載體作為陽性對(duì)照。同時(shí),肝向分化的細(xì)胞爬片,免疫熒光染色檢測(cè)ALB表達(dá)。結(jié)果:⑴.重組質(zhì)粒p DRIVE-SV40-Albp-Lac Z的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄活性最高的ALB啟動(dòng)子片段篩選:從Gene Bank BLAST中獲得三段人白蛋白啟動(dòng)子片段-247/+36(284bp,Fragment 1),-173/-23(151bp,Fragment 2)和-173/+36(210bp,Fragment 3),并成功構(gòu)建三種重組質(zhì)粒p DRIVE-SV40-Albp-Lac Z,轉(zhuǎn)染Hepa1-6,細(xì)胞中均有藍(lán)色沉淀生成。Fragment 3所在質(zhì)粒組細(xì)胞藍(lán)染比率最高。選取Fragment 3用于下一步實(shí)驗(yàn)。⑵.SV40-Albp-Zs Green腺病毒載體的構(gòu)建及對(duì)各組細(xì)胞ALB的檢測(cè):經(jīng)酶切及測(cè)序明確攜帶SV40-Albp和Zs Green基因的SV40-Albp-Zs Green腺病毒載體構(gòu)建成功,TCID 50測(cè)定病毒的感染滴度2×1010 PFU/m L,感染肝臟來源細(xì)胞,顯微鏡下均可見不同程度的綠色熒光,非肝臟來源細(xì)胞無綠色熒光表達(dá)。陽性對(duì)照組中,均出現(xiàn)高亮度的綠色熒光。免疫熒光染色顯示,ALB表達(dá)與Zs Green綠色熒光蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致。⑶.SV40-Albp-Zs Green腺病毒載體對(duì)小鼠BM-MSCs肝向分化細(xì)胞ALB的檢測(cè):成功培養(yǎng)出小鼠BM-MSCs,接種第4-6代后。21天誘導(dǎo)后,SV40-Albp-Zs Green腺病毒載體感染的肝細(xì)胞樣細(xì)胞于倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá),陽性對(duì)照組中,可觀察到高亮度的綠色熒光。免疫熒光染色檢測(cè)的ALB表達(dá)與Zs Green綠色熒光蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致。結(jié)論:⑴.小鼠、大鼠、人白蛋白啟動(dòng)子通用序列中-173/+36(210bp)片段轉(zhuǎn)錄活性最高。⑵.成功構(gòu)建攜帶小鼠、大鼠、人白蛋白啟動(dòng)子通用序列-173/+36(210bp)的SV40-Albp-Zs Green腺病毒載體。⑶.SV40-Albp-Zs Green腺病毒載體可用于小鼠、大鼠、人干細(xì)胞肝向分化狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
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本文編號(hào)：1852030