本文選題：micro-RNA + miR-34a��； 參考：《三峽大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的：隨著生活習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)的變化，近年來脂肪性肝病的發(fā)病率越來越高，成為危害公共衛(wèi)生的重要因素。而飽和游離脂肪酸可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性，，通過“兩次打擊”導(dǎo)致脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)非編碼微小RNAmiR-34a在脂肪性肝病中高表達(dá)，因此，本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用飽和游離脂肪酸及參與脂肪性肝病調(diào)控的miR-34a建立肝細(xì)胞損傷模型，研究它們對肝細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，為進(jìn)一步探索脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)制，以及尋找有效防治脂肪性肝病措施提供前期基礎(chǔ)。 方法：(1)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1和pEGFP-C1/miR-34a質(zhì)粒到HepG2細(xì)胞中，24h后在熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光的表達(dá)；36h后收細(xì)胞通過RT-PCR檢測miR-34a的表達(dá)。(2)不同濃度的棕櫚酸處理正常、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1和pEGFP-C1/miR-34a質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞，MTT法檢測棕櫚酸和miR-34a對HepG2細(xì)胞增殖的影響。(3)實(shí)驗(yàn)分為空白對照、棕櫚酸處理、miR-34a轉(zhuǎn)染、miR-34a轉(zhuǎn)染+棕櫚酸處理四個(gè)組，用DAPI分別給四個(gè)組的細(xì)胞染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化；并用細(xì)胞衰老特異性β-半乳糖苷酶試劑盒檢測細(xì)胞衰老情況。(4)收集四個(gè)處理組的細(xì)胞，用RT-PCR檢測細(xì)胞衰老相關(guān)基因P21，P53，細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK6，CyclinE2，E2F1以及細(xì)胞炎性因子TNF-α，MCP的表達(dá)。(5) western blot檢測四個(gè)處理組細(xì)胞周期蛋白CDK6和細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白Sirt1的表達(dá)。 結(jié)果：(1)由于載體pEGFP-C1帶有GFP基因，因此表達(dá)質(zhì)粒在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1和pEGFP-C1/miR-34a質(zhì)粒到HepG2細(xì)胞中，24h后在熒光顯微鏡下觀察到了綠色熒光的表達(dá)；RT-PCR結(jié)果顯示，36h后miR-34a在其轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中高表達(dá)，而在空載組中表達(dá)為陰性。(2)不同濃度的棕櫚酸處理HepG2細(xì)胞，MTT法檢測棕櫚酸可抑制HepG2細(xì)胞增殖，并且呈劑量依賴關(guān)系；而棕櫚酸和miR-34a聯(lián)合處理細(xì)胞可明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖。(3)研究表明，衰老細(xì)胞的細(xì)胞核體積增大，細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶在酸性條件下被催化生成深藍(lán)色的沉積產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示棕櫚酸和miR-34a聯(lián)合處理細(xì)胞DAPI染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核體積增大，應(yīng)用試劑盒檢測也發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞特異性β-半乳糖苷酶呈深藍(lán)色。(4) RT-PCR結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比較，miR-34a和棕櫚酸聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞，使與細(xì)胞衰老相關(guān)的基因p21，p16，p53，以及炎性細(xì)胞因子MCP，TNF-α的表達(dá)明顯升高，細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK6為低表達(dá)。(5) Western blot發(fā)現(xiàn)棕櫚酸和miR-34a聯(lián)合作用使CDK6和Sirt1的表達(dá)受到抑制。 結(jié)論：研究結(jié)果表明miR-34a和棕櫚酸聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞，可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)HepG2細(xì)胞的衰老，提示高脂及miR-34a在肝細(xì)胞衰老中的重要作用及藥物干預(yù)的潛在靶點(diǎn)。
[Abstract]:Objective: with the changes of living habits and dietary structure, the incidence of fatty liver disease is increasing in recent years, which is an important factor to endanger public health. Saturated free fatty acids can induce fatty degeneration of hepatocytes and lead to the occurrence and development of fatty liver disease through "two blows". Some studies have found that there is a high expression of non-coding micro in fatty liver disease. Therefore, we intend to use saturated free fatty acids and miR-34a involved in the regulation of fatty liver disease to establish hepatocyte injury model. The study of their effects on the biological activity of hepatocytes provides a basis for further exploring the pathogenesis of fatty liver disease and for finding effective measures to prevent and treat fatty liver disease. Methods pEGFP-C1 and pEGFP-C1/miR-34a plasmids were transfected into HepG2 cells for 24 h. The expression of GFP green fluorescence was observed under fluorescence microscope for 36 h. The expression of miR-34a was detected by RT-PCR. The cells were treated with palmitic acid at different concentrations. The effect of palmitic acid and miR-34a on the proliferation of HepG2 cells was assayed by MTT assay. The HepG2 cells transfected with pEGFP-C1 and pEGFP-C1/miR-34a plasmid were divided into four groups: palmiR-34a transfected with miR-34a and palmiR-34a transfected with palmiR-34a. The cells of the four groups were stained with DAPI. The morphologic changes of the nucleus were observed under microscope and the senescence specific 尾 -galactosidase kit was used to detect the senescence of the cells. The expressions of cyclin CDK6 and senescence related protein Sirt1 were detected by RT-PCR, CDK6, cyclin E2E2F1 and TNF- 偽 MCP, respectively. Results because the vector pEGFP-C1 contained GFP gene, green fluorescence could be observed under fluorescence microscope. After transient transfection of pEGFP-C1 and pEGFP-C1/miR-34a plasmids into HepG2 cells for 24 hours, the expression of green fluorescence was observed under fluorescence microscope. The results of RT-PCR showed that miR-34a was highly expressed in HepG2 cells after 36 hours of transfection. HepG2 cells treated with different concentrations of palmitic acid could inhibit the proliferation of HepG2 cells in a dose-dependent manner. However, palmitic acid combined with miR-34a could significantly inhibit the proliferation of HepG2 cells. The results showed that the nuclear volume of aging cells increased and 尾 -galactosidase was catalysed to produce dark blue deposition products under acidic conditions. The results showed that the cell nuclear volume was increased by DAPI staining with palmitic acid and miR-34a, and the cell specific 尾 -galactosidase of the experimental group was dark blue. RT-PCR showed that the cell specific 尾 -galactosidase in the experimental group was dark blue. Compared with the control cells, the combination of miR-34a and palmitic acid on HepG2 cells increased the expression of p21, p16, p53, and the inflammatory cytokine MCP-TNF- 偽. The expression of CDK6 and Sirt1 was inhibited by palmitic acid and miR-34a combined with Western blot. Conclusion: miR-34a combined with palmitic acid can induce 尾 -galactosidase in HepG2 cells, block cell cycle and promote the senescence of HepG2 cells. It is suggested that hyperlipidemia and miR-34a may play an important role in hepatocyte aging and potential targets for drug intervention.
【學(xué)位授予單位】：三峽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R575.5

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本文編號(hào)：1847276