本文選題：IBD + Chemerin�。� 參考：《復旦大學》2014年博士論文

【摘要】：炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一組反復發(fā)作的慢性炎癥性腸道疾病,主要包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn's disease, CD)。 IBD在西方國家非常普遍,患病率達100-200/10萬人。在我國,近10年來IBD的發(fā)病率上升了大約10～20倍。鑒于IBD嚴重危害患者健康并且IBD病人發(fā)生惡變的幾率明顯高于正常人群,研究人員花費了大量精力來探究IBD的致病機理。IBD的發(fā)病機制至今尚未完全闡明,目前認為,IBD是以遺傳易感性為基礎,環(huán)境因素參與,黏膜免疫系統(tǒng)對腸腔內抗原物質(如共生菌)的異常免疫應答而造成的腸道損傷。IBD病人在治療上也仍存在很多問題,例如有部分患者對氨基水楊酸類、激素和免疫抑制劑等藥物治療不敏感以及藥物存在毒副作用等。因而,深入研究其發(fā)病機制將是十分有意義的。目前,免疫因素在炎癥性腸病的發(fā)病學中最為肯定,也是該病的發(fā)病機制研究中與治療目標最接近者。眾多資料顯示,作為免疫系統(tǒng)重要組成部分的免疫細胞在IBD的發(fā)病機制中起重要作用。免疫細胞調控失常將導致腸道免疫缺陷、黏膜免疫耐受破壞、免疫系統(tǒng)異常激活,并最終導致炎癥的發(fā)生。Chemerin是近年來新發(fā)現的一種趨化因子,也稱他扎羅汀誘導基因2(TIG2)或維甲酸受體反應蛋白2 (RARRES2) 。 Chemerin在肝臟和白色脂肪組織中高表達,在肺臟、腎臟、垂體、胎盤及卵巢也有表達。Chemerin以18kDa的低活性的前體蛋白形式分泌,經絲氨酸蛋白酶水解C末端序列后轉化為16k Da的具有生物活性的蛋白質。2007年研究人員還發(fā)現Chemerin也是一種脂肪因子,能夠調節(jié)脂肪細胞分化和代謝,與胰島素抵抗密切相關。更為重要的是,Chemerin可以作為一種趨化因子在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用。Chemerin的受體是G蛋白偶聯受體ChemR23, ChemR23主要表達在未成熟的樹突狀細胞、巨噬細胞和NK細胞表面,Chemerin通過與其受體ChemR23結合來發(fā)揮對表達CheR23細胞的免疫趨化作用,招募這些細胞到淋巴組織和炎癥部位。Chemerin在多種炎癥組織中存在,與組織炎癥密切相關。最近的一些研究報道結果顯示,在不同的炎癥疾病模型中,Chemerin既可能發(fā)揮抗炎作用,又可能發(fā)揮促炎作用。有研究報道,在炎癥性腸病病人的血清中的Chemerin的濃度增加,然而Chemerin對炎癥性腸病中的發(fā)生發(fā)展起到何種作用目前尚不清楚。在本課題的研究中,我們利用DSS誘導的腸炎小鼠模型結合臨床病人數據對Chemerin在炎癥性腸病(IBD)中的作用及其機制進行了探究性研究。在第一小節(jié)的研究中,我們成功建立了DSS誘導的小鼠結腸炎模型,我們發(fā)現DSS誘導的腸炎小鼠中,無論是血清還是腸道局部組織,Chemerin的表達水平都是顯著上升的。我們收集了UC病人結腸組織樣本,同樣發(fā)現Chemerin表達水平的上調,而且Chemerin的表達水平與腸炎的惡性程度呈正相關。在第二小節(jié)的研究中,我們在DSS誘導的小鼠腸炎小鼠中腹腔注射外源重組Chemerin蛋白,發(fā)現給予外源重組Chemerin可以顯著促進DSS誘導的小鼠腸炎,DSS誘導的腸炎小鼠在給予Chemerin之后表現出更為嚴重的臨床癥狀,如體重下降更為顯著、結腸長度縮短加劇、DAI評分增高、結腸內部水腫、糜爛、出血、潰瘍等現象加重；組織病理學上,給予Chemerin之后的腸炎小鼠更高的臨床病理評分,切片觀察可見更為嚴重的黏膜上皮紊亂、杯狀細胞更為減少、細胞脫落更為嚴重、腺體破壞加劇、隱窩基本消失、黏膜下層更為增寬。這些加重的臨床癥狀和病理評分證實了Chemerin對小鼠腸炎的促進作用。在第三小節(jié)的研究中,我們檢測了給予Chemerin之后,DSS誘導的腸炎小鼠的血清中和腸道組織局部的促炎因子IL-6, TNF-a和IFN-γ的表達水平,發(fā)現這些促炎因子表達水平顯著增加。我們接著檢測了給予外源重組Chemerin是否影響結腸組織中炎癥性細胞的趨化。結果我們發(fā)現,給予外源重組Chemerin并不影響結腸組織中炎癥性細胞的浸潤比例。在第四小節(jié)的研究中,我們檢測了Chemerin是否影響巨噬細胞向M2的極化。我們發(fā)現,給予重組Chemerin可以顯著降低DSS誘導的腸炎小鼠結腸組織中M2相關基因的表達,包括Arginase 1 (Arg-1)、Ym1、FIZZ1和IL-10,表明hemerin可能抑制了炎癥小鼠結腸組織中巨噬細胞向M2的極化。在體外實驗中,我們進一步證實了Chemerin可以抑制M2相關基因的表達,而這一抑制作用可能是通過Chemerin抑制IL-4誘導的STAT6的磷酸化來發(fā)揮的。在第五小節(jié)的研究中,我們使用Chemerin中和抗體進一步從反向驗證了上述結論。我們發(fā)現給予Chemerin中和抗體可以顯著抑制DSS誘導的小鼠腸炎。與前面結果相一致的是,阻斷內源性的Chemerin雖然能夠抑制促炎因子的表達,但是并不影響腸炎小鼠結腸組織中炎癥細胞的浸潤,而阻斷內源性的Chemerin則能夠顯著增加M2相關基因的表達。綜上所述,我們的研究結果表明Chemerin在DSS誘導的小鼠腸炎中起促進炎癥的作用；Chemerin可以抑制巨噬細胞向抗炎的M2方向的極化,這可能是Chemerin促進腸道炎癥的機制之一；腸道局部上調表達的Chemerin蛋白可能是IBD的發(fā)病機理之一。肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC),簡稱肝癌,是嚴重威脅人類生命的一種上皮類惡性腫瘤。肝癌早期發(fā)病隱匿,發(fā)展迅速,易轉移,大多數患者在確診時己發(fā)生轉移,不宜或無法切除,這是肝癌致死率居于惡性腫瘤第三位的重要原因。因此,探討肝癌發(fā)生和發(fā)展過程中的調控機制,不僅有助于完善肝癌分子網絡,而且有助于發(fā)現新型肝癌標志分子、開發(fā)新的藥物靶點,對肝癌臨床診斷和治療都具有重要的價值。傳統(tǒng)的肝癌研究注重腫瘤細胞自身,試圖從癌細胞本身基因與表型改變來解釋腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉移。最近的研究越來越關注作為腫瘤密不可分的局部微環(huán)境對腫瘤演進所起的重要作用。大量研究表明,很多惡性腫瘤存在炎癥性的微環(huán)境。炎癥與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,炎癥應答在腫瘤形成過程中的各個階段(啟動、惡變、轉移)均發(fā)揮重要作用,炎癥促腫瘤的具體細胞分子機制的研究是腫瘤免疫研究的熱點之一。對于肝癌,炎癥免疫微環(huán)境是其發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移中的重要組成部分。肝癌發(fā)生發(fā)展往往存在“炎-癌”鏈的作用,臨床上大部分肝癌患者有乙型或(和)丙型肝炎以及肝硬化背景。炎癥和肝硬化導致的細胞增殖異常可以促進腫瘤的演進和進展。因此,肝癌炎癥微環(huán)境與肝癌的發(fā)生發(fā)展和復發(fā)轉移有著密切的關系。肝癌炎癥微環(huán)境中浸潤著大量的免疫細胞,而且每種免疫細胞包括多種具有特異性表型和功能的亞群。例如,T淋巴細胞包括：Th1細胞、Th2細胞、Treg細胞、Th17細胞、TFH細胞和細胞毒性T細胞等多種細胞亞群；巨噬細胞可根據表型和功能的不同分為經典激活的巨噬細胞(classically activated macrophages, M1型巨噬細胞)和選擇性激活的巨噬細胞(alternatively activated macrophages, M2型巨噬細胞)。此外,在腫瘤患者的外周血及腫瘤組織中廣泛存在著一群髓樣來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSC), MDSC又分為中性粒細胞樣MDSC (PMN-MDSC)和單核細胞樣MDSC (M-MDSC)倆個亞群。研究這些免疫細胞及其亞群在腫瘤“組織微定位”的表型、分布和功能有助于深入理解炎癥反應調控腫瘤進展的機制,為新型免疫治療提供理論支持。肝癌炎癥微環(huán)境中的抗腫瘤和促腫瘤機制相互對抗,它們之間的博弈就像一場曠日持久的戰(zhàn)爭。在這場戰(zhàn)役中,腫瘤微環(huán)境通過各種因子、介質誘導出一系列免疫抑制性的細胞。在腫瘤組織中,樹突狀細胞(DC)分化為具有免疫抑制功能的調節(jié)性DC (regulatory dendritic cells, DCreg),巨噬細胞分化為具有免疫抑制作用的腫瘤相關巨噬細胞(tum orassociated macrophage, TAM);此外,腫瘤組織中MDSC的正常分化也受到抑制并大量擴增。MDSC作為腫瘤組織中重要的免疫抑制細胞,參與了腫瘤的免疫逃逸、免疫耐受、免疫抑制等病理過程,促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤組織中的TAM具有M2的表型,可直接來源于組織常駐的巨噬細胞,也可由MDSC進一步分化而來。而腫瘤組織的MDSC來源于骨髓祖細胞和未成熟髓細胞,其中PMN-MDSC與M-MDSC發(fā)揮免疫抑制的機制不盡相同。腫瘤組織中PMN-MDSC的擴增明顯高于M-DMSC,而且腫瘤組織中的M-MDSC可以分化為PMN-MDSC。肝癌組織中的MDSC以PMN-MDSC為主。Chemerin是近年來新發(fā)現的一種趨化因子,在肝臟和脂肪組織表達量最高。Chemerin的主要功能受體是G蛋白偶聯受體ChemR23, ChemR23主要表達于未成熟DC (mDC)、pDC、巨噬細胞和NK細胞表面。Chemerin在組織免疫和炎癥應答中發(fā)揮重要作用。在不同的疾病模型中,Chemerin既可以發(fā)揮促進炎癥的功能,也可以發(fā)揮抑制炎癥的功能。研究報道,Chemerin既可以通過介導pDC、mDC、單核細胞和粒細胞對組織的浸潤來發(fā)揮調節(jié)炎癥的作用,也可以通過影響炎癥組織中的細胞因子、介質的表達來調控炎癥應答,還可以通過調控各種免疫細胞的和基質細胞的功能來發(fā)揮作用。我們實驗室對Chemerin在炎癥中的調控作用也做了大量研究工作。我們發(fā)現,在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的皮膚組織中,Chemerin可能通過促進pDC的浸潤促進炎癥;在過敏性哮喘小鼠的氣道炎癥中,Chemerin抑制炎性DC的氣道浸潤,從而下調Th2介導的過敏性炎癥[12]。正如論文第一部分所敘述的那樣,我們還發(fā)現,Chemerin在腸道炎癥中發(fā)揮促炎作用,Chemerin可以抑制具有修復功能的M2巨噬細胞的應答,體外研究證實Chemerin通過抑制巨噬細胞STAT6的磷酸化來抑制IL-4誘導的M2巨噬細胞的極化。雖然Chemerin最初是從卵巢癌或肝癌患者的腹水中分離得到,但是Chemerin在腫瘤中的研究報道還很少,雖然一些研究結果提示了Chemerin與腫瘤發(fā)生發(fā)展中相關性,但是Chemerin影響腫瘤的具體機制的研究報道到目前為止還非常少,僅在2012年Pachynski R等研究報道Chemerin可能通過介導NK細胞對黑色素瘤腫瘤組織的浸潤而發(fā)揮其抗腫瘤效應。文獻報道人正常肝臟組織高水平表達Chemerin和ChemR23,肝細胞和肝星狀細胞同時表達Chemerin和ChemR23;而肝臟Kupffer細胞和膽管細胞表達ChemR23而不表達Chemerin [18]。雖然Chemerin在肝臟中大量表達且作為脂肪因子在代謝中的作用已被大量研究,但是Chemerin與肝癌的相互關系卻很少有人研究。只有2013年一篇來自國內的研究報道中提到肝癌組織中Chemerin的表達水平下調,并伴隨著NK細胞浸潤的降低,與預后相關,提示Chemerin可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展,但Chemerin如何影響肝癌及其具體作用機制尚未見任何報道。因此,我們在前期對Chemerin調節(jié)炎癥的研究工作的基礎上,結合Chemerin及其受體ChemR23在肝臟的高表達,進一步探究了Chemerin對肝癌及其相關炎癥微環(huán)境的作用及其機制。在本課題的研究中,我們首先探究了Chemerin對肝癌的發(fā)生發(fā)展是否有作用,這種作用是促進還是抑制。在論文第一部分的研究中,我們發(fā)現Chemerin可以促進腸道組織的炎癥的發(fā)生發(fā)展,而這種促進作用并不是通過Chemerin對免疫細胞的趨化作用而發(fā)揮的,而是通過Chemerin抑制腸道組織巨噬細胞向M2的極化而發(fā)揮促炎作用的。那么,在肝癌發(fā)生發(fā)展中,Chemerin是作為一種趨化因子影響免疫細胞的浸潤來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展?還是通過影響免疫細胞或者基質細胞的功能來發(fā)揮影響肝癌的作用的呢?對此,我們進行了初步的探究。在第一小節(jié)研究中,我們收集肝癌患者的癌癥組織和癌旁組織,用免疫組化的手段檢測Chemerin在腫瘤組織中的表達變化,我們發(fā)現,相比癌旁組織,腫瘤組織中的Chemerin表達顯著降低。我們利用組織芯片結合臨床隨訪資料,確定了Chemerin與肝癌的惡性程度呈負相關,與預后呈正相關。通過檢測不同侵襲能力的人肝癌細胞株以及肝癌和癌旁組織細胞中Chemerin的表達水平,發(fā)現Chemerin表達水平隨著細胞轉移能力的增強而降低,提示Chemerin與肝癌的惡性轉移呈負相關。在第二小節(jié)研究中,我們利用穩(wěn)定轉染Chemerin基因的肝癌細胞株Hepal-6,建立了倆種小鼠肝癌模型,一種是肝癌的皮下移植瘤模型,另一種是肝臟原位移植瘤模型。在這倆種肝癌模型中,我們均發(fā)現過表達Chemerin可以顯著抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。我們將穩(wěn)定轉染的Hepal-6細胞進行眼球后靜脈叢注射,發(fā)現過表達Chemerin可以顯著抑制肝癌細胞的肺轉移。在第三小節(jié)的研究中,我們檢測了過表達Chemerin對肝癌細胞Hepal-6本身生物學特性的影響,我們發(fā)現Chemerin不影響Hepal-6的增殖、凋亡、細胞周期和趨化。我們檢測了肝癌組織浸潤的免疫細胞的比例變化。我們發(fā)現Chemerin可以促進CD45+免疫細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞的浸潤,顯著減少巨噬細胞、M2型巨噬細胞、粒細胞樣MDSC的比例。在第四小節(jié)的研究中,我們發(fā)現Chemerin不影響腫瘤組織中的PMN-MDSC的增殖和趨化,但是Chemerin可以顯著抑制腫瘤組織中M-MDSC向PMN-MDSC的分化。綜上所述,在第二部分的研究中,我們證實了Chemerin對肝癌的抑制作用并初步探究了Chemerin調節(jié)肝癌及其炎癥微環(huán)境的作用機制,但是Chemerin抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的更為詳盡的調節(jié)機制還需要大量工作來進一步研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R574.62;R735.7

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前5條

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本文編號：1778913