本文選題：肝纖維化 + 肝星狀細(xì)胞�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：肝纖維化是多種慢性肝臟疾病向肝硬化發(fā)展過程中的必經(jīng)階段,是各種病因?qū)е卵装Y、壞死等組織損傷的修復(fù)反應(yīng)。若肝纖維化進(jìn)程得不到阻抑或逆轉(zhuǎn)則可能進(jìn)展為失代償期肝硬化,并出現(xiàn)各種終末期肝病并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量和預(yù)后。但目前肝纖維化的治療效果不甚理想,尚乏有效治療手段。因此,對(duì)肝纖維化的深入研究極具必要性和重要意義。肝纖維化的病理特征是細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過量沉積。肝臟內(nèi)多種細(xì)胞以不同形式參與肝纖維化形成,其中肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)的活化、增殖,產(chǎn)生大量ECM是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞,主要通過吞噬作用清除病原體和異物,并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。此外,巨噬細(xì)胞還具有免疫調(diào)節(jié)和抗原遞呈功能。既往研究證實(shí)在肝纖維化發(fā)生階段持續(xù)的損傷刺激可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向肝臟募集并分泌大量具有促炎、促纖維化功能的細(xì)胞因子,通過促進(jìn)HSCs活化和增殖參與肝纖維化進(jìn)程,在該過程中通過減少巨噬細(xì)胞向肝臟募集或抑制其功能均能減輕肝纖維化程度。然而,在肝纖維化恢復(fù)階段巨噬細(xì)胞發(fā)揮截然相反的作用,主要通過分泌一系列基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)加速ECM降解,在此過程中減少巨噬細(xì)胞募集可顯著阻止肝纖維化恢復(fù)。因此,深入研究巨噬細(xì)胞功能及其作用機(jī)制可能為臨床中肝纖維化的治療提供新思路。腫瘤壞死因子樣配體1A(TNF-like ligand 1 aberrance,TL1A)又稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子(vascular endothelial growth inhibitor,VEGI),是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤壞死因子家族新成員,主要有促進(jìn)炎癥反應(yīng)和抑制血管生成兩方面作用。對(duì)TL1A促進(jìn)炎癥反應(yīng)的研究主要集中在自身免疫性疾病領(lǐng)域,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)等。其中,在硫酸葡聚糖(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎模型中發(fā)現(xiàn)髓系單核細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)高表達(dá)TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比腸纖維化程度更重,而應(yīng)用TL1A抗體干預(yù)可減輕腸道炎癥和纖維化,從而證實(shí)TL1A參與腸纖維化發(fā)生。近期在原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)的臨床研究中發(fā)現(xiàn),PBC患者血清和肝組織中TL1A表達(dá)顯著高于正常人群,并進(jìn)一步在肝組織枯否細(xì)胞和浸潤(rùn)的單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TL1A表達(dá)增加,提示TL1A可能參與肝纖維化發(fā)生。TL1A與血管生成的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域。業(yè)已證實(shí),TL1A通過抑制血管生成抑制腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。血管生成在肝纖維化發(fā)生和逆轉(zhuǎn)階段發(fā)揮截然相反的作用。在肝纖維化發(fā)生時(shí),肝細(xì)胞水腫、炎癥壞死造成局部組織缺氧促進(jìn)新生血管生成,有助于炎細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)發(fā)生,從而加重肝纖維化,在此過程中通過抑制血管生成可減輕肝纖維化程度。近期研究發(fā)現(xiàn),血管生成利于巨噬細(xì)胞向肝臟募集,在肝纖維化逆轉(zhuǎn)階段促進(jìn)ECM降解。但目前尚無TL1A及其相關(guān)的血管改變?cè)诟卫w維化逆轉(zhuǎn)中的研究。本實(shí)驗(yàn)通過CCl4腹腔注射構(gòu)建肝纖維化模型及其自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型,利用髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠作對(duì)比,探討髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A在肝纖維化發(fā)生和逆轉(zhuǎn)中的作用。提取兩種小鼠的骨髓來源巨噬細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞,研究TL1A對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。進(jìn)一步收集巨噬細(xì)胞上清液干預(yù)小鼠原代HSCs,探討TL1A高表達(dá)巨噬細(xì)胞在HSCs膠原代謝中的作用。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下三部分:第一部分髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A對(duì)實(shí)驗(yàn)性小鼠肝纖維化發(fā)生的影響目的:探討髓系細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)高表達(dá)TL1A對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和肝纖維化程度的影響。方法:將髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠(FMS-TL1AGFP-transgenic,M-Tg)與有相同遺傳背景的C57BL/6野生型(wild type,WT)小鼠(6~8周)隨機(jī)分為Control/WT組、Oil/WT組、CCl4/WT組、Control/Tg組、Oil/Tg組及CCl4/Tg組,每組10只。采用腹腔注射10%CCl4橄欖油溶液(5μL·g-1,每周二、五分別給藥一次)建立小鼠肝纖維化模型,并設(shè)立單純注射生理鹽水和橄欖油作為對(duì)照(Control)組和橄欖油溶劑對(duì)照(Oil)組。采用F4/80和TL1A免疫熒光雙標(biāo)記法檢測(cè)TL1A的定位分布,Real-time Q-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)TL1A在肝組織中的定量表達(dá);自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠肝功能改變;Haematoxylin and eosin staining(HE染色)觀察肝臟組織病理學(xué)改變;末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記(terminal deoxynucleotidy transferrase UTP-nick end labeling,TUNEL)法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況;天狼猩紅染色方法和羥脯氨酸檢測(cè)法評(píng)估肝纖維化程度;免疫組織化學(xué)染色、Real-time Q-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)Collagen1α1和α-SMA表達(dá)變化;Real-time Q-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)MMP-2和MMP-9表達(dá)變化。結(jié)果:1)應(yīng)用基因FMS-TL1A-GFP特定引物序列擴(kuò)增小鼠DNA后凝膠成像測(cè)定,Tg小鼠目的基因在191 bp位置成像,而WT小鼠在191 bp位置無目的基因表達(dá),據(jù)此可以篩選鑒定髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠。2)小鼠肝纖維化模型成功建立:CCl4/WT組肝組織HE染色可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)增多、小葉結(jié)構(gòu)紊亂、匯管區(qū)擴(kuò)大;天狼猩紅染色顯示纖維結(jié)締組織明顯增多。3)CCl4/WT組肝組織中TL1A和F4/80免疫熒光共染方法檢測(cè)到TL1A表達(dá)于巨噬細(xì)胞中。檢測(cè)TL1A的平均光密度顯示,CCl4/WT組中平均光密度值顯著高于Oil/WT組(0.031±0.005 vs0.021±0.003,P0.01);CCl4/Tg組顯著高于CCl4/WT組(0.053±0.007 vs0.031±0.005,P0.01)。Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中TL1A m RNA表達(dá),CCl4/WT組中TL1A m RNA的相對(duì)表達(dá)量(3.57±0.81)顯著高于Control/WT組(1±0.02)和Oil/WT組(1.29±0.31),P0.01;CCl4/Tg組的TL1A m RNA相對(duì)表達(dá)量(11.5±1.87)顯著高于Control/Tg組(6.94±0.71)和Oil/Tg組(7.08±1.15),P0.01;且CCl4/Tg組顯著高于CCl4/WT組(11.5±1.87 vs 3.57±0.81,P0.01)。Western blot分析各組TL1A蛋白表達(dá),CCl4/WT組中TL1A蛋白表達(dá)量(0.26±0.05)顯著高于Control/WT組(0.13±0.02)和Oil/WT組(0.15±0.05);CCl4/Tg組中TL1A蛋白表達(dá)量(0.72±0.08)顯著高于Control/Tg組(0.36±0.04)和Oil/Tg組(0.38±0.05),P0.05;且CCl4/Tg組顯著高于CCl4/WT組(0.72±0.08vs 0.26±0.05,P0.01)。4)生化法檢測(cè)各組肝功能變化,Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間ALT、AST和TBIL水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;CCl4/WT組肝功能損傷明顯重于Oil/WT組(ALT:190.4 U/L±10.4 U/L vs 8.3 U/L±3.7 U/L,P0.05;AST:220.5U/L±19.3 U/L vs 58.5 U/L±14.5 U/L,P0.05;TBIL:6μmol/L±1.07μmol/L vs 2.81μmol/L±0.66μmol/L,P0.05);CCl4/Tg組肝功能損傷明顯重于CCl4/WT組(ALT:222.4 U/L±5.2 U/L vs 190.4 U/L±10.4 U/L,P0.05;AST:270.8 U/L±19.7 U/L vs 220.5 U/L±19.3 U/L,P0.05;TBIL:9.09μmol/L±0.9μmol/L vs 6μmol/L±1.07μmol/L,P0.05)。5)HE染色觀察肝組織內(nèi)肝細(xì)胞壞死情況,Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組未見肝細(xì)胞壞死;CCl4/WT組和CCl4/Tg組可見肝細(xì)胞水腫、胞漿疏松化,肝內(nèi)匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加,匯管區(qū)及周圍碎屑樣壞死。壞死面積統(tǒng)計(jì)CCl4/Tg組較CCl4/WT組顯著升高(39.5%±5.1%vs 25.8%±3.6%,P0.05)。6)TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況,Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組每個(gè)視野下凋亡細(xì)胞的數(shù)量分別為4±1、5±2、5±1、4±1,各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CCl4/WT組比Oil/WT組肝細(xì)胞凋亡明顯增多(28±5 vs 5±2,P0.01),CCl4/Tg組比CCl4/WT組肝細(xì)胞凋亡顯著增加(46±6 vs 28±5,P0.01)。7)天狼猩紅染色陽性面積百分比在Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組依次為0.24%±0.05%、0.28%±0.08%、0.27%±0.04%、0.26%±0.06%,各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;CCl4/WT組的陽性面積(1.43%±0.21%)明顯高于Oil/WT組,P0.01;且CCl4/Tg組的陽性面積(1.85%±0.14%)明顯高于CCl4/WT組,P0.01。羥脯氨酸法檢測(cè)總膠原水平,Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組羥脯氨酸含量依次為83μg/g±5μg/g、89μg/g±7μg/g、86μg/g±8μg/g、92μg/g±10μg/g,各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;CCl4/WT(130μg/g±10μg/g)組較Oil/WT組羥脯氨酸含量明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組(162μg/g±14μg/g)較CCl4/WT組明顯升高,P0.05。8)免疫組織化學(xué)染色、Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)各組Collagen1α1表達(dá),在Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組間Collagen1α1表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)Collagen1α1陽性面積顯示CCl4/WT組(1.26%±0.31%)顯著高于Oil/WT組(0.3%±0.13%),P0.01;CCl4/Tg組的陽性染色面積顯著高于CCl4/WT組(2.96%±0.72%vs 1.26%±0.31%,P0.01)。Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中Collagen1α1 m RNA的表達(dá),CCl4/WT組相對(duì)表達(dá)量(3.67±0.48)較Oil/WT組(1.24±0.2)明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(5.08±0.72 vs 3.67±0.48,P0.01);Western blot技術(shù)檢測(cè)各組Collagen1α1蛋白表達(dá),CCl4/WT組(0.85±0.07)較Oil/WT組(0.68±0.08)Collagen1α1蛋白的表達(dá)量明顯升高,P0.05;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(1.27±0.08 vs 0.85±0.07,P0.01)。9)免疫組織化學(xué)染色、Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)各組α-SMA表達(dá),在Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組間α-SMA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá),CCl4/WT組陽性染色面積(2.73%±0.68%)顯著高于Oil/WT組(0.34%±0.08%),P0.01;CCl4/Tg組的陽性染色面積顯著高于CCl4/WT組(3.85%±0.65%vs 2.73%±0.68%,P0.05)。Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中α-SMA m RNA的表達(dá),CCl4/WT組α-SMA m RNA的相對(duì)表達(dá)量(3.18±1.25)較Oil/WT組(1.17±0.16)明顯升高,P0.05;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(4.6±0.6 vs 3.18±1.25,P0.05)。Western blot技術(shù)檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá),CCl4/WT組(1.35±0.11)較Oil/WT組(1.01±0.08)α-SMA蛋白的表達(dá)量明顯升高,P0.05;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(1.63±0.1 vs 1.35±0.11,P0.01)。10)Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織中MMP-2的表達(dá),Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.05;MMP-2 m RNA的相對(duì)表達(dá)量在CCl4/WT組(5.3±1.6)較Oil/WT組(1.02±0.23)明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(10.4±2.8 vs 5.3±1.6,P0.01)。MMP-2蛋白表達(dá)在CCl4/WT組(1.15±0.11)較Oil/WT組(0.55±0.08)明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(1.31±0.06 vs 1.15±0.11,P0.05)。11)Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織中MMP-9的表達(dá),Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.05;MMP-9 m RNA的表達(dá)在CCl4/WT組(4.99±1.73)較Oil/WT組(1.08±0.14)明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(9.97±1.97 vs 4.99±1.73,P0.01)。MMP-9蛋白表達(dá)在CCl4/WT組(0.51±0.09)較Oil/WT組(0.22±0.04)明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(0.72±0.12 vs 0.51±0.09,P0.05)。第二部分TL1A高表達(dá)的巨噬細(xì)胞參與肝纖維化進(jìn)程的機(jī)制目的:探討TL1A高表達(dá)的巨噬細(xì)胞參與肝纖維進(jìn)程的體內(nèi)外機(jī)制。方法:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組同第一部分。巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)部分,分別提取野生型C57BL/6小鼠和髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage,BMMs)和腹腔巨噬細(xì)胞(peritoneal macrophages,PMs),分組如下:PMs分組:Control/WT組、LPS+IFN-γ/WT組、Control/Tg組、LPS+IFN-γ/Tg組,其中Control組為提取出PMs后用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h;LPS+IFN-γ組為提取出PMs后用含100 ng/m L脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和25 ng/m L干擾素-γ(interferon,IFN-γ)培養(yǎng)72 h;BMMs分組:Control/WT組、M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組、Control/Tg組、M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組,首先提取出骨髓造血干細(xì)胞,應(yīng)用含10 ng/m L巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)9天誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞,Control組為繼續(xù)應(yīng)用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h,M-CSF+LPS+IFN-γ組為應(yīng)用含10 ng/m L M-CSF、100 ng/m L LPS和25 ng/m L IFN-γ的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。收集上述分組中的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基用于細(xì)胞因子檢測(cè)和作為干預(yù)HSCs的條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM)。應(yīng)用原位循環(huán)灌流和密度梯度離心技術(shù)分離野生型小鼠HSCs,用BMMs和PMs的條件養(yǎng)基干預(yù),實(shí)驗(yàn)分組如下。PMs的CM干預(yù)HSCs分組:Control組(用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs 24 h);LPS+IFN-γ組(用含40 ng/m L LPS和10 ng/m L IFN-γ的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs 24h);CM/WT組(用含40%野生型小鼠PMs CM的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs 24 h);CM/Tg組(用含40%轉(zhuǎn)基因小鼠PMs CM的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs 24 h)。BMMs的CM干預(yù)HSCs分組:Control組(用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs 24h);M-CSF+LPS+IFN-γ組(用含4 ng/m L M-CSF、40 ng/m L LPS和10ng/m L IFN-γ的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs 24 h);CM/WT組(用含40%野生型小鼠BMMs CM的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs 24 h);CM/Tg組(用含40%轉(zhuǎn)基因小鼠BMMs CM的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs 24 h)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和Real time Q-PCR方法檢測(cè)肝組織中F4/80表達(dá)。Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織中C-C趨化因子配體2(C C chemokine ligand2,CCL2)表達(dá)。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)血清、巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基,Real time Q-PCR方法檢測(cè)肝組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor beta,TGF-β1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表達(dá)。Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)HSCs中Collagen1α1、MMP-13和組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP-1)表達(dá)。結(jié)果:1)Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中F4/80 m RNA的相對(duì)表達(dá)量,Control/WT組(1±0.12)、Oil/WT組(1.16±0.22)、Control/Tg組(1.23±0.2)和Oil/Tg組(1.3±0.18)之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;CCl4/WT組(3.95±0.9)較Oil/WT組F4/80 m RNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(6.3±0.95 vs 3.95±0.9,P0.05)。免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)各組F4/80表達(dá),Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組F4/80陽性染色面積依次為:0.98%±0.23%、1.03%±0.31%、1.02%±0.16%、1%±0.29%,各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;CCl4/WT組陽性染色面積(3.7%±1.1%)顯著高于Oil/WT組,P0.01;且CCl4/Tg組的陽性染色面積顯著高于CCl4/WT組(6.52%±1.74%vs 3.7%±1.1%,P0.01)。2)Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織中CCL2表達(dá),Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;CCl4/WT組(5.7±1.6)較Oil/WT組(1.17±0.37)CCL2 m RNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(10.74±2.87 vs 5.7±1.6,P0.05)。CCL2蛋白在CCl4/WT組(1.25±0.12)較Oil/WT組(0.85±0.07)表達(dá)量明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(1.81±0.16 vs 1.25±0.12,P0.01)。3)成功提取小鼠骨髓造血干細(xì)胞,并誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞,成功提取并純化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞;通過LPS聯(lián)合IFN-γ促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化,從而獲得活化的高表達(dá)TL1A巨噬細(xì)胞和野生型巨噬細(xì)胞。4)ELISA方法檢測(cè)血清中TGF-β1含量、Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中TGF-β1 m RNA的表達(dá),Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;血清TGF-β1含量在CCl4/WT組(184pg/ml±17.3 pg/ml)較Oil/WT組(89.1 pg/ml±7.4 pg/ml)明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(253.6 pg/ml±11.4 pg/ml vs 184 pg/ml±17.3 pg/ml,P0.01)。肝組織中TGF-β1 m RNA的表達(dá)在CCl4/WT組(3.83±1.23)較Oil/WT組(1.22±0.33)明顯升高,P0.05;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(6.45±1.35 vs 3.83±1.23,P0.05)。ELISA方法檢測(cè)BMMs上清液中Control/WT組、Control/Tg組、M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組、M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組TGF-β1含量依次為2679.73 pg/ml±167.01 pg/ml、2495.08 pg/ml±264.47 pg/ml、2515.08pg/ml±164.47 pg/ml、2572.08 pg/ml±216.35 pg/ml,4組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。檢測(cè)PMs上清液中TGF-β1含量,與BMMs結(jié)果趨勢(shì)一致。5)采用ELISA方法檢測(cè)血清中PDGF-BB含量、Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中PDGF-BB m RNA的表達(dá),Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;血清PDGF-BB含量在CCl4/WT組(2253.2 pg/ml±297.4 pg/ml)較Oil/WT組(601.7 pg/ml±121.7 pg/ml)明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(3008.7 pg/ml±295.9 pg/ml vs 2253.2 pg/ml±297.4 pg/ml,P0.01)。PDGF-BB m RNA的相對(duì)表達(dá)量在CCl4/WT組(2.04±0.57)較Oil/WT組(1.07±0.14)明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(3.04±0.33 vs 2.04±0.57,P0.01)。ELISA方法檢測(cè)BMMs培養(yǎng)液上清中PDGF-BB含量,Control/WT組(7838.38 pg/ml±882.11 pg/ml)與Control/Tg組(8320.44 pg/ml±1038.59 pg/ml)相比無明顯差異,P0.05;而M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組比M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組明顯升高(15447.36 pg/ml±1129.50 pg/ml vs 11464.79 pg/ml±1402.97 pg/ml,P0.01)。檢測(cè)PMs上清液中PDGF-BB含量,與BMMs結(jié)果趨勢(shì)一致。6)采用ELISA方法檢測(cè)血清中TNF-α含量、Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中TNF-αm RNA的表達(dá),Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;TNF-α含量在CCl4/WT組(61.2 pg/ml±11.8 pg/ml)較Oil/WT組(26.9 pg/ml±5.8 pg/ml)明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(104 pg/ml±18.4 pg/ml vs 61.2pg/ml±11.8 pg/ml,P0.01)。TNF-αm RNA的相對(duì)表達(dá)量在CCl4/WT組(4.97±0.8)較Oil/WT組(1.09±0.4)明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(8.8±2.5 vs 4.97±0.8,P0.05)。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)BMMs上清液中TNF-α含量,Control/WT組、Control/Tg組、M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組、M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組依次為182.19pg/ml±54.74 pg/ml、195.33 pg/ml±45.57 pg/ml、4128.07 pg/ml±331.40pg/ml、4613.5 pg/ml±238.15 pg/ml,其中Control/Tg組略高于Control/WT組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組明顯高于Control/WT組,P0.01;M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組明顯高于M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組(4613.5 pg/ml±238.15 pg/ml vs 4128.07 pg/ml±331.40 pg/ml,P0.05)。檢測(cè)PMs上清液中TNF-α含量,與BMMs結(jié)果趨勢(shì)一致。7)采用ELISA方法檢測(cè)血清中IL-1β含量、Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中pro-IL-1βm RNA的表達(dá),Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;血清中IL-1β含量在CCl4/WT組(43.5 pg/ml±9.1 pg/ml)較Oil/WT組(29.3 pg/ml±4.7 pg/ml)明顯升高,P0.05;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(64.6 pg/ml±11.3 pg/ml vs43.5 pg/ml±9.1 pg/ml,P0.01)。Pro-IL-1βm RNA的相對(duì)表達(dá)量在CCl4/WT組(4.89±0.68)較Oil/WT組(1.12±0.4)明顯升高,P0.01;CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高(5.93±0.55 vs 4.89±0.68,P0.05)。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)BMMs培養(yǎng)液上清中IL-1β含量,Control/WT組(34.57pg/ml±3.11 pg/ml)與Control/Tg組(36.62 pg/ml±3.54 pg/ml)相比無顯著性差異,P0.05;而M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組比M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組增加明顯(121.08 pg/ml±6.68 pg/ml vs 94.10 pg/ml±5.19 pg/ml,P0.01)。檢測(cè)PMs上清液中IL-1β含量,與BMMs結(jié)果趨勢(shì)一致。8)應(yīng)用原位灌注、密度梯度離心法分離小鼠原代HSCs,熒光顯微鏡(波長(zhǎng)328 nm)觀察可見初分離的小鼠原代HSCs由于富含維生素A脂滴,呈自發(fā)藍(lán)綠色熒光;應(yīng)用Desmin免疫熒光染色鑒定分離出的HSCs,在倒置熒光顯微鏡下陽性細(xì)胞胞漿內(nèi)可見綠色熒光,Desmin染色陽性率約93%。9)應(yīng)用BMMs條件培養(yǎng)基干預(yù)原代HSCs 24 h后,Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)HSCs中Collagen1α1的表達(dá),M-CSF+LPS+IFN-γ組與Control組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;CM/WT組(1.88±0.14)較M-CSF+LPS+IFN-γ組(1.06±0.08)Collagen1α1 m RNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高,P0.01;CM/Tg組中Collagen1α1 m RNA的相對(duì)表達(dá)量較CM/WT組明顯升高(2.65±0.18 vs 1.88±0.14,P0.01)。CM/WT組Collagen1α1蛋白定量(0.74±0.07)較M-CSF+LPS+IFN-γ組(0.53±0.05)明顯升高,P0.01;CM/Tg組Collagen1α1蛋白定量較CM/WT組明顯升高(0.96±0.14vs 0.74±0.07,P0.01)。應(yīng)用PMs條件培養(yǎng)基干預(yù)后檢測(cè)HSCs中Collagen1α1表達(dá)趨勢(shì)與BMMs相一致。10)應(yīng)用BMMs條件培養(yǎng)基干預(yù)原代HSCs 24 h后,Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)HSCs中MMP-13的表達(dá),M-CSF+LPS+IFN-γ組與Control組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;CM/WT組的MMP-13 m RNA相對(duì)表達(dá)量(0.84±0.12)明顯低于M-CSF+LPS+IFN-γ組(1.03±0.04),P0.05;CM/Tg組中MMP-13m RNA的相對(duì)表達(dá)量(0.77±0.08)與CM/WT組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。CM/WT組中MMP-13蛋白表達(dá)量(0.35±0.06)比M-CSF+LPS+IFN-γ組(0.46±0.03)明顯下降,P0.01;CM/Tg組中MMP-13蛋白表達(dá)量(0.37±0.04)與CM/WT組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。應(yīng)用PMs條件培養(yǎng)基干預(yù)后檢測(cè)HSCs中MMP-13表達(dá),趨勢(shì)與BMMs相一致。11)應(yīng)用BMMs條件培養(yǎng)基干預(yù)原代HSCs 24 h后,Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)HSCs中TIMP-1的表達(dá),M-CSF+LPS+IFN-γ組與Control組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;CM/WT組的TIMP-1 m RNA相對(duì)表達(dá)量(1.79±0.07)明顯高于M-CSF+LPS+IFN-γ組(1.04±0.05),P0.01;CM/Tg組中TIMP-1 m RNA的相對(duì)表達(dá)量較CM/WT組明顯升高(2.14±0.16 vs 1.79±0.07,P0.01)。CM/WT組中TIMP-1蛋白表達(dá)量(0.62±0.1)比M-CSF+LPS+IFN-γ組(0.35±0.06)明顯升高,P0.01;CM/Tg組中TIMP-1蛋白表達(dá)量較CM/WT組明顯升高(0.85±0.12 vs 0.62±0.1,P0.01)。應(yīng)用PMs條件培養(yǎng)基干預(yù)后檢測(cè)HSCs中TIMP-1表達(dá),趨勢(shì)與BMMs相一致。第三部分髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A在實(shí)驗(yàn)性小鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中的作用目的:探討髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A對(duì)小鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)、血管生成及巨噬細(xì)胞募集的影響。方法:將Tg小鼠與WT小鼠隨機(jī)分為Oil/WT組(每周2次腹腔注射橄欖油溶液5μL·g-1,持續(xù)6周)、CCl4 6 wk/WT組(每周2次腹腔注射10%CCl4橄欖油溶液5μL·g-1,持續(xù)6周)、CCl4 Re 1 wk/WT組(完成上述肝纖維化造模后停藥恢復(fù)1周,分組中用Re代替逆轉(zhuǎn)reversion)、CCl4 Re 2 wk/WT組(完成上述肝纖維化造模后停藥恢復(fù)2周)、Oil/Tg組(處理方式同Oil/WT組)、CCl4 6 wk/Tg組(處理方式同CCl4 6 wk/WT組)、CCl4 Re 1 wk/Tg組(處理方式同CCl4 Re 1 wk/WT組)、CCl4 Re 2wk/Tg組(處理方式同CCl4 Re 2 wk/WT組),每組各10只。應(yīng)用天狼猩紅染色和羥脯氨酸檢測(cè)了解纖維組織降解情況;免疫組織化學(xué)染色、Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織Collagen1α1表達(dá);免疫熒光法和Western blot方法檢測(cè)血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1(Platelet endothelial cell adhesion molecule 1,PECAM-1)也稱為分化抗原簇31(cluster of differentiation 31,CD31)表達(dá);免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織中F4/80表達(dá);Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織中MMP-13和TIMP-1表達(dá)。結(jié)果:1)天狼猩紅染色后統(tǒng)計(jì)各組中纖維結(jié)締組織所占面積百分比,Oil/WT組與Oil/Tg組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.27%±0.06%vs0.25%±0.08%,P0.05);CCl4 6 wk/Tg組、CCl4 Re 1 wk/Tg組和CCl4 Re2 wk/Tg組均明顯高于相對(duì)應(yīng)的CCl4 6 wk/WT組、CCl4 Re 1 wk/WT組和CCl4 Re 2 wk/WT組;CCl4 Re 1 wk/Tg組天狼猩紅染色陽性面積百分比較CCl4 6 wk/Tg組下降約1.07%,CCl4 Re 1 wk/WT組較CCl4 6 wk/WT組下降約1.08%;CCl4 Re 2 wk/Tg組天狼猩紅染色陽性面積百分比較CCl4 Re 1wk/Tg組下降約0.52%,CCl4 Re 2 wk/WT組天狼猩紅染色陽性面積百分比較CCl4 Re 1 wk/WT組下降約0.83%。檢測(cè)各組羥脯氨酸含量,Oil/WT組與Oil/Tg組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(92μg/g±10μg/g vs 89μg/g±7μg/g,P0.05);CCl4 6 wk/Tg組、CCl4 Re 1 wk/Tg組和CCl4 Re 2 wk/Tg組均明顯高于相對(duì)應(yīng)的CCl4 6 wk/WT組、CCl4 Re 1 wk/WT組和CCl4 Re 2wk/WT組;CCl4 Re 1 wk/WT組羥脯氨酸含量較CCl4 6 wk/WT組下降約23μg/g,而CCl4 Re 1 wk/Tg組較CCl4 6 wk/Tg組下降約17μg/g;CCl4 Re2 wk/WT組羥脯氨酸含量較CCl4 Re 1 wk/WT組下降約42μg/g,而CCl4Re 2 wk/Tg組較CCl4 Re 1 wk/Tg組下降約31μg/g。2)應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織中Collagen1α1表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Oil/WT組與Oil/Tg組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CCl4 6 wk/Tg組、CCl4 Re 1 wk/Tg組和CCl4 Re 2 wk/Tg組中Collagen1α1表達(dá)均明顯高于相對(duì)應(yīng)的CCl4 6 wk/WT組、CCl4 Re 1 wk/WT組和CCl4 Re 2 wk/WT組。3)免疫組織熒光染色和Western blot檢測(cè)CD31表達(dá),Oil/Tg組、CCl4 6 wk/Tg組、CCl4 Re 1 wk/Tg組和CCl4 Re 2 wk/Tg組中CD31表達(dá)均明顯低于相對(duì)應(yīng)的Oil/WT組、CCl4 6 wk/WT組、CCl4 Re 1 wk/WT組和CCl4Re 2 wk/WT組。4)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肝組織中F4/80表達(dá),Oil/Tg組與Oil/WT組之間F4/80陽性染色面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.13%±0.37%vs 1.15%±0.4%,P0.05);CCl4 6 wk/Tg組與CCl4 6 wk/WT組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.22%±0.27%vs 2.82%±0.36%,P0.05);CCl4 Re 1 wk/Tg組F4/80陽性染色面積明顯低于CCl4 Re 1 wk/WT組(4.04%±0.47%vs5.98%±1.32%,P0.05);CCl4 Re 2 wk/Tg組F4/80陽性染色面積明顯低于CCl4 Re 2 wk/WT組(1.91%±0.29%vs 2.32%±0.22%,P0.05)。5)Real time Q-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)各組中MMP-13表達(dá),Oil/WT組與Oil/Tg組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.05;CCl4 6 wk/Tg組與CCl4 6 wk/WT組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;MMP-13 m RNA在CCl4 Re 1 wk/Tg組明顯低于CCl4 Re 1 wk/WT組(3.58±0.4 vs 4.54±0.43,P0.01);MMP-13m RNA在CCl4 Re 2 wk/Tg組明顯低于CCl4 Re 2 wk/WT組(1.85±0.3 vs2.28±0.24,P0.05)。MMP-13蛋白檢測(cè)與上述檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致。6)采用Real time Q-PCR檢測(cè)各組中TIMP-1 m RNA表達(dá),Oil/WT組與Oil/Tg組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.03±0.33 vs 0.95±0.04,P0.05);CCl4 6 wk/Tg組TIMP-1 m RNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于CCl4 6 wk/WT組(5.21±0.53 vs4.14±0.56,P0.01);CCl4 Re 1 wk/Tg組TIMP-1 m RNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于CCl4 Re 1 wk/WT組(4.12±0.62 vs 3±0.44,P0.01);CCl4 Re 2 wk/Tg組TIMP-1 m RNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于CCl4 Re 2 wk/WT組(2.39±0.54 vs1.6±0.17,P0.05)。Western blot技術(shù)檢測(cè)各組中TIMP-1蛋白表達(dá),結(jié)果顯示:Oil/Tg組與Oil/Tg組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.32±0.05 vs0.35±0.06,P0.05);CCl4 6 wk/Tg組TIMP-1蛋白表達(dá)明顯高于CCl4 6wk/WT組(0.92±0.1 vs 0.64±0.06,P0.01);CCl4 Re 1 wk/Tg組TIMP-1蛋白表達(dá)明顯高于CCl4 Re 1 wk/WT組(0.78±0.07 vs 0.47±0.05,P0.01);CCl4 Re 2 wk/Tg組TIMP-1蛋白表達(dá)明顯高于CCl4 Re 2 wk/WT組(0.55±0.1 vs 0.38±0.06,P0.01)。結(jié)論:1在CCl4誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性小鼠肝纖維化模型肝組織中和巨噬細(xì)胞內(nèi)TL1A表達(dá)明顯升高。2在肝纖維化發(fā)生過程中,髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向肝臟募集,加重肝功能損傷、肝細(xì)胞壞死和凋亡;上調(diào)肝組織中TGF-β1、PDGF-BB、TNF-α和IL-1β表達(dá),從而進(jìn)一步促進(jìn)HSCs活化和Collagen1α1合成。3高表達(dá)TL1A的巨噬細(xì)胞可促進(jìn)自身分泌PDGF-BB、TNF-α和IL-1β;高表達(dá)TL1A的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基干預(yù)小鼠原代HSCs更顯著地促進(jìn)HSCs內(nèi)Collagen1α1合成并抑制其降解。4在小鼠肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型中,髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A通過抑制血管生成、減少巨噬細(xì)胞募集、降低MMP-13表達(dá)及升高TIMP-1表達(dá)阻止肝纖維化逆轉(zhuǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575.2
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本文編號(hào)：1742761