本文選題：肝衰竭 + 肝損傷��； 參考：《鄭州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：肝衰竭是常見(jiàn)的危重癥,死亡率高達(dá)70~80%。肝衰竭的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,其治療仍是世界性難題。在肝衰竭中,存在大量肝細(xì)胞壞死,肝功能受損,肝細(xì)胞再生和分化障礙,是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一。殘存的肝細(xì)胞無(wú)法滿足機(jī)體的需要,導(dǎo)致肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和代謝功能紊亂,引發(fā)如血氨、乳酸、間接膽紅素等代謝產(chǎn)物蓄積。目前“二次損傷”學(xué)說(shuō)是肝衰竭發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一,肝衰竭最常見(jiàn)的代謝紊亂---高血氨,其神經(jīng)毒性已經(jīng)被眾多學(xué)者研究,但是它是否會(huì)造成肝臟的二次損傷未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。我們以高血氨為研究肝衰竭的切入點(diǎn),前期首次建立高血氨攻擊大鼠模型,證實(shí)高血氨可以誘導(dǎo)大鼠肝臟的“二次損傷”,但是尚未在細(xì)胞水平研究高血氨對(duì)人肝細(xì)胞的損傷作用及其機(jī)制。肝臟是人體非常重要的代謝器官,當(dāng)肝臟出現(xiàn)病理改變,必然伴隨與之相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)的變化。因此研究高血氨對(duì)肝細(xì)胞損傷機(jī)制,不能僅著眼于肝細(xì)胞本身的損傷,還需要用整體性思維即系統(tǒng)生物學(xué)來(lái)研究。高血氨誘導(dǎo)肝損傷的代謝組學(xué)研究在國(guó)際上鮮有報(bào)道。于是研究高血氨誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷及其代謝組學(xué),為揭示高血氨在肝衰竭中的分子生物學(xué)機(jī)制提供理論基礎(chǔ),并為肝衰竭的預(yù)防和治療提供新的干預(yù)策略和作用靶點(diǎn)。方法1氨對(duì)肝細(xì)胞特異性損傷作用首先構(gòu)建高血氨細(xì)胞模型,采用CCK-8法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)氨對(duì)不同細(xì)胞系增殖和凋亡的影響,探討氨對(duì)肝臟細(xì)胞的損傷和凋亡作用是否具有特異性。采用Real-time PCR和Western Bloting檢測(cè)氨轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白:Rh C型糖蛋白(Rh family,C glycoprotein,RHCG)和水通道蛋白8(aquaporin-8,AQP8)的表達(dá),探討其特異性機(jī)制。采用電子顯微鏡和活體細(xì)胞線粒體膜通道孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore,m PTP)熒光檢測(cè),觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)并檢測(cè)線粒體膜通透性,以探討其可能的損傷機(jī)制。2氨對(duì)肝細(xì)胞代謝譜的影響建立以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技術(shù)為基礎(chǔ)的高血氨細(xì)胞模型代謝組學(xué)方法,了解高血氨對(duì)肝細(xì)胞代謝譜的影響,結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析和比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)等方法,篩選并鑒定出差異代謝產(chǎn)物,找出差異代謝通路。根據(jù)GC-MS結(jié)果提供的相關(guān)線索,結(jié)合Real-time PCR、Western Bloting等技術(shù)對(duì)差異代謝通路進(jìn)行驗(yàn)證和深入研究。結(jié)果 1氨對(duì)肝細(xì)胞具有特異性損傷作用1.1氨對(duì)肝細(xì)胞增殖和形態(tài)的影響以及建模濃度的選擇隨著氨濃度增加和(或)處理時(shí)間的延長(zhǎng),原代肝細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖受到明顯的抑制,顯微鏡下,肝細(xì)胞生長(zhǎng)密度也隨之顯著下降并最終出現(xiàn)空泡現(xiàn)象。10 m M的氨濃度是理想的建模濃度。1.2氨對(duì)肝類細(xì)胞和非肝類細(xì)胞增殖和凋亡的影響(1)氨抑制肝類細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,尤其是原代肝細(xì)胞;對(duì)非肝類細(xì)胞生長(zhǎng)影響不大。(2)氨能明顯誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞凋亡,而對(duì)其它類型的細(xì)胞凋亡影響不大1.3氨對(duì)不同細(xì)胞系氨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響氨能明顯影響原代肝細(xì)胞氨轉(zhuǎn)運(yùn)體RHCG、AQP8 m RNA和蛋白的表達(dá),其它細(xì)胞系氨轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)不受氨的影響。1.4氨對(duì)肝功能酶學(xué)指標(biāo)的影響與對(duì)照組相比,高氨細(xì)胞模型中谷胱甘肽(glutathione,GSH)呈現(xiàn)先降低然后又恢復(fù)正常的趨勢(shì),谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)呈現(xiàn)先明顯上升后又顯著下降的趨勢(shì),天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate transaminase,AST)在最初的48小時(shí)之前無(wú)明顯差異,之后呈現(xiàn)明顯升高的趨勢(shì)。環(huán)氧化物水解酶(cyclo-oxygen-ase,COX)在24小時(shí)之后呈現(xiàn)明顯升高的趨勢(shì)。1.5氨對(duì)肝細(xì)胞線粒體損傷和凋亡的影響電鏡下高氨環(huán)境的肝細(xì)胞線粒體出現(xiàn)腫脹、變圓、嵴紊亂和空泡化等形態(tài)變化,氨誘導(dǎo)m PTP,增加線粒體通透性。與此同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。2氨對(duì)肝細(xì)胞代謝譜的影響1)建立GC-MS檢測(cè)高氨肝細(xì)胞模型代謝譜的方法,通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析方法,發(fā)現(xiàn)氨處理組與未處理組代謝存在顯著差異。2)GC-MS檢測(cè)到648個(gè)代謝產(chǎn)物,找到120個(gè)差異代謝產(chǎn)物,并根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定代謝產(chǎn)物,找出主要差異代謝通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨處理組三羧酸循環(huán)、尿素循環(huán)和嘌呤嘧啶通路等均出現(xiàn)代謝障礙。(1)氨對(duì)三羧酸循環(huán)的影響氨處理組的三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)物如檸檬酸、α-酮戊二酸、蘋(píng)果酸水平都顯著降低,并檢測(cè)到ATP生成減少。(2)氨對(duì)尿素循環(huán)的影響高氨環(huán)境下尿素水平并沒(méi)有升高,而是與未處理組相比無(wú)明顯差異。精氨酸水平明顯降低,鳥(niǎo)氨酸水平輕度升高。并且檢測(cè)到尿素循環(huán)關(guān)鍵的限速酶同時(shí)也是代謝氨的關(guān)鍵酶CPS-I明顯受到氨的抑制。而參與氨代謝的另一個(gè)重要酶——氨甲酰磷酸合成酶II(carbamoylphosphate synthetase II,CPS-II),即CPS-I的同工酶,其的表達(dá)增強(qiáng)。即高氨環(huán)境下CPS-I表達(dá)減弱,而CPS-II表達(dá)增強(qiáng)(3)氨對(duì)嘌呤嘧啶代謝的影響在氨處理組中,嘌呤通路代謝產(chǎn)物肌苷、黃嘌呤水平較對(duì)照組明顯減少;嘧啶通路中乳清酸、尿嘧啶、β-丙氨酸、胞嘧啶、異丁二酸水平與對(duì)照組相比也明顯減少,而胸苷酸是增多的。乳清酸是核酸合成的重要前體物質(zhì),結(jié)合Real-time PCR和Western Bloting技術(shù)檢測(cè)并驗(yàn)證催化乳清酸合成的關(guān)鍵酶二氫乳清酸脫氫酶在高氨狀態(tài)下表達(dá)抑制,14C-UTP摻入法檢測(cè)到RNA的合成障礙。3差異代謝產(chǎn)物對(duì)高氨細(xì)胞模型的影響與其他差異代謝物相比,乳清酸可以明顯逆轉(zhuǎn)氨對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用。其具有促進(jìn)肝細(xì)胞增殖再生,減輕凋亡,提高RNA合成的作用。結(jié)論 1.氨對(duì)肝細(xì)胞具有特異性損傷,其特異性機(jī)制與細(xì)胞膜上的氨轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)蛋白R(shí)HCG和AQP8的表達(dá)有關(guān),其損傷機(jī)制與氨啟動(dòng)線粒體凋亡途徑有關(guān)。2.氨導(dǎo)致肝細(xì)胞三羧酸循環(huán)、尿素循環(huán)和RNA合成障礙。首次提出在高氨環(huán)境下,尿素循環(huán)存在障礙,不能有效代謝氨,多余的氨進(jìn)入由CPS-II參與的氨代謝通路的理論。乳清酸可以明顯逆轉(zhuǎn)氨對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用,促進(jìn)肝細(xì)胞再生,它如果和有效促進(jìn)內(nèi)源性ATP生成的藥物結(jié)合應(yīng)用,可能是未來(lái)研發(fā)治療肝衰竭新藥物頗具前景的方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575.3

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本文編號(hào)：1739376