本文選題：肝肺綜合征　切入點(diǎn)：肺微血管擴(kuò)張　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的： 肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome, HPS)是以肝病或門脈高壓為基礎(chǔ)形成的一種以肺微血管擴(kuò)張和低氧血癥為主要特征的嚴(yán)重血管并發(fā)癥。HPS一旦發(fā)生，肝病患者的死亡率顯著增加。肺微血管擴(kuò)張是HPS最主要的病理變化。周細(xì)胞位于微血管壁外側(cè)，其細(xì)胞突觸呈放射狀，沿著血管長軸方向分布，這些突觸與多個內(nèi)皮細(xì)胞表面連接，像“爪子”一樣牢固的盤踞在微血管壁上，這些特點(diǎn)使周細(xì)胞具有調(diào)節(jié)微血管管徑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；此外，周細(xì)胞還表達(dá)豐富的與細(xì)胞收縮相關(guān)的蛋白和蛋白激酶，這些特性使周細(xì)胞具有調(diào)節(jié)微血管管徑的功能基礎(chǔ)。近年部分研究發(fā)現(xiàn)caspase-3激活是周細(xì)胞減少的重要調(diào)節(jié)信號，而周細(xì)胞的減少又與某些病理性血管擴(kuò)張有關(guān)。但是，肺周細(xì)胞減少是否與HPS肺微血管擴(kuò)張相關(guān)，尚不清楚。膽總管結(jié)扎(common bile ductligation, CBDL)模型是目前國內(nèi)外公認(rèn)的HPS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。本研究通過培養(yǎng)肺周細(xì)胞，觀察CBDL大鼠血清對肺周細(xì)胞凋亡和caspase-3表達(dá)的影響；觀察CBDL大鼠肺細(xì)胞凋亡、caspase-3表達(dá)情況和周細(xì)胞的主要標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)、神經(jīng)元膠質(zhì)抗原2(neuron-glial antigen2, NG2)、desmin的蛋白水平及其陽性細(xì)胞率的變化；抑制caspase-3后檢測肺細(xì)胞凋亡，α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其陽性細(xì)胞率的變化，以及肺微血管擴(kuò)張和血氧交換情況，證明如下假設(shè)：CBDL產(chǎn)生的血清因子變化，通過血液循環(huán)作用于肺微血管，致caspase-3激活，肺周細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引起肺微血管擴(kuò)張、血氧交換異常和低氧血癥，最終揭示肺周細(xì)胞凋亡在HPS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头挝⒀軘U(kuò)張中的重要作用。 方法： 1CBDL大鼠血清對肺周細(xì)胞凋亡的作用研究 1.1肺周細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定。 1.2采用CBDL法構(gòu)建HPS大鼠模型，，收集CBDL1wk血清。 1.3CBDL大鼠血清培養(yǎng)肺周細(xì)胞后，分別用TUNEL和western blot檢測其凋亡和caspase-3表達(dá)情況。 2CBDL大鼠中肺周細(xì)胞的變化研究 2.1采用CBDL法構(gòu)建HPS大鼠模型。 2.2分別用TUNEL和western blot檢測CBDL大鼠肺細(xì)胞的凋亡和caspase-3的表達(dá)。 2.3分別用western blot和免疫組化法檢測CBDL大鼠肺α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其陽性細(xì)胞率的變化。 3抑制caspase-3對CBDL大鼠肺周細(xì)胞的影響及HPS的作用研究 3.1采用CBDL法構(gòu)建HPS大鼠模型，手術(shù)后第一天起每天給模型大鼠腹腔注射caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK，連續(xù)2wk。 3.2用TUNEL法檢測抑制caspase-3后CBDL大鼠肺細(xì)胞的凋亡情況。 3.3分別用western blot和免疫組化法檢測抑制caspase-3后CBDL大鼠肺α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其陽性細(xì)胞率的變化。 3.4分別用血?dú)夥治龊虷E染色法觀察抑制caspase-3后CBDL大鼠血氧交換和肺微血管擴(kuò)張情況。 結(jié)果： 1.成功培養(yǎng)出高純度的肺周細(xì)胞：倒置顯微鏡下見培養(yǎng)的細(xì)胞呈梭型或星芒狀，單核，偶見雙核，核卵圓形，有細(xì)胞突起，漩渦或柵欄狀生長，無接觸性抑制；經(jīng)α-SMA、desmin和NG2免疫熒光染色測定為陽性，CD31染色為陰性。 2. CBDL大鼠血清促進(jìn)肺周細(xì)胞中TUNEL陽性細(xì)胞的增加和caspase-3的表達(dá)。 3. CBDL后肺TUNEL陽性細(xì)胞和caspase-3表達(dá)顯著增加然后逐漸降低，其中CBDL1wk時為最高值，α-SMA、desmin、NG2的表達(dá)水平及其陽性細(xì)胞率顯著減少。 4.早期使用caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK顯著降低了CBDL大鼠肺TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量，抑制了α-SMA、desmin、NG2的表達(dá)水平及其陽性細(xì)胞率的下降，減輕了肺微血管擴(kuò)張，改善了血氧交換。 結(jié)論： 1.成功建立了一套簡單有效的肺周細(xì)胞培養(yǎng)方法。 2. CBDL引起的血清變化促進(jìn)了肺周細(xì)胞凋亡。 3. Caspase-3激活導(dǎo)致肺周細(xì)胞凋亡可能是CBDL大鼠肺α-SMA、desmin和NG2表達(dá)水平及其陽性細(xì)胞率下降的原因。 4.早期使用caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK可能通過減少CBDL大鼠肺周細(xì)胞凋亡，從而抑制肺微血管擴(kuò)張和HPS形成。早期抑制caspase-3可能成為預(yù)防實(shí)驗(yàn)性HPS形成的一種有效措施。
[Abstract]:Background and purpose:
Hepatopulmonary syndrome (hepatopulmonary syndrome HPS) is a liver disease or portal hypertension is a basic form to the pulmonary micro vascular complications of.HPS serious vascular dilatation and hypoxemia as the main feature of the event, patients with liver disease mortality increased significantly. The pulmonary microvascular expansion is the main pathological changes of HPS cells in the micro week. The vessel wall outside the cell synapses were radial distribution along the long axis of the vessel, synaptic connections with multiple endothelial cell surface, like "claws" firmly entrenched in the microvascular wall, these features make the cell structure is adjusting the peripheral microvascular diameter; in addition, peripheral cells also express the rich contraction associated protein and protein kinase and cell, these properties make cells has the function of adjusting the microvascular diameter. In recent years, some studies have found that caspase-3 activation is reduced the weight of pericytes To adjust the signal, and reduce the pericytes is related to some pathological vascular dilatation. However, peripheral lung cells decreased whether microvascular expansion associated with lung HPS, is unclear. Common bile duct ligation (common bile, ductligation, CBDL) model is recognized at home and abroad at present HPS model. In this study, through the cultivation of peripheral lung to observe the effect of serum cell CBDL expression in rats of peripheral lung cell apoptosis and caspase-3; observation of lung cell apoptosis in CBDL rats, the expression of Caspase-3 and the main sign of pericytes protein alpha smooth muscle actin (-smoothmuscle alpha actin, alpha -SMA), glial antigen 2 (neuron-glial antigen2, NG2), desmin protein level changes and the rate of positive cells; detection of lung cell apoptosis, inhibition of Caspase-3 alpha -SMA, desmin, NG2 protein level and its change rate of positive cells, and pulmonary capillary dilation and oxygen exchange And prove the following hypothesis: the changes of serum cytokines CBDL, on pulmonary microvascular function through blood circulation, induced caspase-3 activation, peripheral lung cell apoptosis, thereby causing pulmonary capillaries, oxygen exchange abnormalities and hypoxemia, and finally reveals the important role of apoptosis in peripheral pulmonary HPS experimental model of pulmonary microvascular expansion.
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本文編號：1629758