本文選題：肝實質(zhì)細胞　切入點：NLRP3炎癥體　出處：《第三軍醫(yī)大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：炎癥體（inflammasomes）是存在于細胞內(nèi)的一類多蛋白復合物，作為機體對內(nèi)外源危險信號的應答平臺，通過促進IL-18和IL-1β等效應細胞因子活化，或通過誘導細胞pyroptosis（一種程序化、炎性的細胞死亡方式），啟動炎癥應答，促進機體固有免疫應答和后天獲得性的免疫應答，以達到防御感染、維護機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的目的。啟動炎癥體形成的感受器蛋白主要包括有兩大家族：NLR家族（NOD樣蛋白家族）和ALR（AIM2樣蛋白家族）家族，它們在病原菌相關(guān)模式分子（PAMPs）和組織損傷相關(guān)模式分子（DAMPs）刺激下，招募接頭蛋白和pro-caspase-1，組裝成為約700kD的巨分子復合物——炎癥體，聚集在一起的pro-caspase-1通過自體切割方式導致caspase-1活化，活化的caspase-1進一步切割pro-IL-1β和pro-IL-18，生成活性IL-1β和IL-18，并促進它們分泌到細胞外來發(fā)揮各種炎癥效應；或通過誘導細胞死亡（pyroptosis）來啟動炎癥。 NLR（NOD-like receptor）家族是啟動的炎癥體形成的主要感受器蛋白，NLR家族成員包括NLRP1、 NLRP3、NLRC4和NLRP6。在分子結(jié)構(gòu)特點上，NLR家族包含：核苷酸連接區(qū)域和寡聚化結(jié)構(gòu)域（NACHT），位于兩側(cè)的通常分別是C-端富含亮氨酸的重復序列（LRRs）和N-端招募caspase的結(jié)構(gòu)域（CARD）或熱蛋白結(jié)構(gòu)域（PYD）。目前認為LRRs在配體識別和蛋白質(zhì)自身調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用，，而CARD功能域和PYD功能域，可通過調(diào)控同型蛋白質(zhì)相互作用介導下游信號。NACHT結(jié)構(gòu)域是唯一所有NLR家族成員所共有的結(jié)構(gòu)域，可通過依賴ATP的寡聚化作用激活信號復合體。NLRP3沒有CARD功能域，因此，需要先通過它的PYD功能域招募adaptor蛋白ASC，再通過ASC的CARD功能域征募caspase-1酶原來活化caspase-1。 在活化信號上，NLR家族擁有眾多的活化信號，其中，NLRP3的活化信號最為廣泛多樣，NLRP3炎癥體可以在眾多病原體（細菌、病毒、真菌）或非病原體來源刺激物（比如ATP、尿酸、硅晶體、淀粉樣蛋白β）刺激下活化，參與炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展，但NLRP3蛋白質(zhì)分子被認為不可能通過物理作用結(jié)合結(jié)構(gòu)如此多樣的信號分子。因此，很可能通過某些共同的中間途徑引起NLRP3炎癥體的活化，目前已經(jīng)提出了三條活化途徑，包括：（1）NLRP3活化劑ATP可以通過泛連接蛋白半通道引起P2X7-依賴的細胞膜孔的形成，因此導致細胞外的NLRP3激活物通過細胞膜孔進入細胞質(zhì)直接活化NLRP3；（2）內(nèi)吞入細胞的微粒和晶狀體，它們的物理特性損傷溶酶體，引起溶酶體內(nèi)容物（例如，組織蛋白酶B）釋放到胞漿活化NLRP3炎癥體；（3）包括ATP、微粒、晶體等在內(nèi)的各種DAMPs和PAMPs都可以引起細胞內(nèi)活性氧ROS產(chǎn)生，并通過依賴活性氧ROS途徑來活化NLRP3炎癥體。近來有證據(jù)進一步顯示，也許這3個不同的途徑都是通過鉀離子外流的增加這一共同途徑，導致NLRP3炎癥體活化。 目前已經(jīng)有部分研究涉及到了炎癥體功能失調(diào)與各種臨床疾病的關(guān)系，證實NLRP3炎癥體在抗病毒、心血管疾病等眾多疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。研究證實炎癥體可參與機體抗菌固有免疫應答，甲型流感病毒是NLRP3的間接活化劑。感染甲型流感病毒時，機體可通過依賴Toll樣受體7（TLR7，Toll-like receptor7）識別病毒RNA，并引起NLRP3炎癥體組分轉(zhuǎn)錄水平升高。隨后，活化的病毒M2離子通道蛋白引起反面高爾基網(wǎng)（即分泌面高爾基網(wǎng)絡）PH中和作用，進一步引起鉀離子外流和活性氧ROS形成，促進NLRP3炎癥體活化。如我們所知，膽固醇沉積于動脈血管是動脈粥樣硬化特異性的病征，膽固醇晶體通過破壞吞噬溶酶體穩(wěn)定性方式，活化弱氧化修飾低密度脂蛋白（mmLDL，minimal modified low density lipoprotein）預激的小鼠和人巨噬細胞內(nèi)NLRP3炎癥體。不僅如此，研究者發(fā)現(xiàn)，通過骨髓再造（使缺乏NLRP3，ASC或IL-1α/β），明顯的抑制了低密度脂蛋白LDL受體基因敲除小鼠（易患動脈粥樣硬化）動脈粥樣硬化的發(fā)展，提示造血系統(tǒng)NLRP3炎癥體活化和IL-1分泌在動脈粥樣硬化疾病早期階段扮演重要的角色。 慢性乙型肝炎是由嗜肝病毒HBV感染肝細胞導致的慢性肝臟損傷。全球超過50%肝癌是繼發(fā)于慢性乙型肝炎，雖然臨床抗病毒治療使慢性乙型肝炎向肝癌的轉(zhuǎn)歸得到部分控制，但仍然有約一半的病人難以完全控制肝臟持續(xù)的炎癥性損傷，以及慢性肝硬化轉(zhuǎn)歸的結(jié)局。已經(jīng)有多篇文獻報道，IL-1β可能在在肝纖維化過程中具有重要的促進作用，由于IL-1β同時也是炎癥體活化的重要產(chǎn)物，我們高度懷疑炎癥體功能失調(diào)可能在慢性乙型肝炎的進展中具有重要作用。介于NLRP3炎癥體有著廣泛多樣的活化信號，并且也證實在機體其他慢性炎性疾病中具有重要作用，NLRP3炎癥體功能失調(diào)參與慢性乙型肝炎的疾病進展的可能最大。另外，越來越多的證據(jù)表明，有許多非骨髓來源細胞也表達的NLRP3炎癥體，比如脂肪細胞、心肌細胞/心肌成纖維細胞等，并在糖尿病、心肌梗死等相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展進程中扮演重要角色。肝臟主要由組成細胞是實質(zhì)細胞，占到了肝臟體積的80%，而包括肝星形細胞（HSC）、枯否細胞（KC）和肝竇內(nèi)皮細胞（SEC）等在內(nèi)的肝臟非實質(zhì)細胞僅占肝體積的6.5%。因此，我們擬通過了解NLRP3炎癥體各組分在慢性乙肝病人肝組織和正常肝細胞中的表達和功能，來初步判斷NLRP3炎癥體是否有可能參與慢性乙肝的發(fā)病，為進一步深入研究NLRP3炎癥體在慢性乙型肝炎中的功能奠定基礎。 綜上，本課題研究分為兩個部分，第一部分為檢測NLRP3炎癥體各組分在原位肝組織和肝細胞株的表達，通過細胞免疫組化、Western blot等確定人正常肝細胞株L02和人肝癌細胞株HepG2細胞內(nèi)均有NLRP3炎癥體及相關(guān)部件的表達（以Thp-1細胞株作為陽性對照），也發(fā)現(xiàn)NLRP3、caspase-1、IL-1β在乙型肝炎肝組織與正常肝組織切片均有表達，乙型肝炎病人中NLRP3炎癥體表達明確，但在正常肝組織切片中，表達較弱。第二部分研究NLRP3炎癥體在肝細胞中的功能，主要通過相應的危險信號刺激，檢測肝實質(zhì)細胞內(nèi)NLRP3炎癥體是否具有相應的炎癥響應功能。結(jié)果顯示在內(nèi)源性危險信號ATP的刺激下，肝細胞株HepG2/L02的IL-1β分泌明顯增高，肝癌細胞株HepG2表現(xiàn)出比胎肝細胞株L02更高的IL-1β分泌能力，但肝細胞總體上的炎癥響應能力都弱于單核-巨噬細胞，在1.5×106接種，1.5ml體系培養(yǎng)，5Mm ATP刺激6h(100ng/ml LPS預激12h)的同等情況下，Thp-1分泌的IL-1β為500-1000pg/ml，HepG2為300-600pg/ml，L02僅為20-50pg/ml，但考慮到肝臟中肝細胞的總體數(shù)量，因此，在慢性乙型肝炎疾病進程中，肝細胞來源的炎癥應答能力不可小覷�？傊�，本研究旨在明確肝臟實質(zhì)細胞NLRP3炎癥體的表達和炎癥應答能力，為進一步探究NLRP3炎癥體在CHB疾病進程中發(fā)揮的作用奠定基礎或提供理論線索。 一、實驗方法： 1）第一部分：NLRP3炎癥體在肝細胞中的表達 1．通過細胞免疫組化和細胞免疫熒光法，檢測正常肝細胞株L02和人肝癌細胞株HepG2細胞內(nèi)NLRP3炎癥體及相關(guān)部件的表達情況，并以單核-巨噬細胞株Thp-1作為陽性對照； 2．通過免疫組化或免疫熒光檢測乙型肝炎肝組織與正常肝組織NLRP3炎癥體、caspase-1、IL-1β的表達（以扁桃體組織作為陽性對照），以明確NLRP3炎癥體及炎癥體相關(guān)部件在乙型肝炎肝組織和正常肝組織中的原位表達情況和表達差異； 3．通過Western Blot檢測胎肝細胞株L02、肝癌細胞株HepG2和肝組織中內(nèi)NLRP3炎癥體的表達，以明確NLRP3炎癥體在肝實質(zhì)細胞、肝組織內(nèi)的蛋白分子表達情況，并以GAPDH表達量為內(nèi)參，利用Quanity One軟件半定量分析NLRP3炎癥體在乙型肝炎肝組織和正常肝組織中的蛋白分子表達水平的差異； 2）第二部分：NLRP3炎癥體在肝細胞內(nèi)的功能 1．通過RT-PCR、RT-real-time PCR檢測LPS炎性刺激對胎肝細胞株L02和肝癌細胞株HepG2細胞內(nèi)caspase-1、IL-1β基因表達的影響，以了解炎性刺激對肝細胞內(nèi)炎癥體相關(guān)部件基因表達水平的影響； 2．ATP作為NLRP3炎癥體的經(jīng)典激活劑，LPS、LPS+ATP分組刺激肝細胞株L02/HepG2，并通過Western Blot檢測L02/HepG2胞內(nèi)caspase-1活化片段；通過ELISA檢測在LPS、LPS/ATP或LPS/ATP/Y-VAD-fmk刺激下，肝細胞株L02/HepG2和單核巨噬細胞株Thp-1細胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-18分泌情況，以明確正常肝細胞NLRP3炎癥體是否為功能性表達，能否對內(nèi)源性危險信號具有明確的炎癥響應。 二、實驗結(jié)果： 1．免疫組化和免疫熒光的結(jié)果顯示，在HepG2/L02肝細胞內(nèi)檢測到有NLRP3和capsape-1表達不明顯，LPS刺激24h可促進NLRP3炎癥體在HepG2/L02中的表達；在正常肝組織內(nèi)NLRP3、caspase-1、IL-1β雖然有表達，但表達水平很低，而乙型肝炎肝組織NLRP3炎癥體的表達較正常肝組織顯著增高，免疫組化未檢測到caspase-3在乙肝肝組織中表達； 2．RT-PCR、RT-real-time PCR結(jié)果顯示，LPS刺激18h左右，L02、HepG2肝細胞內(nèi)caspase-1、IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均增高；而LPS短時的刺激在4h左右稍微增高，說明這兩株肝實質(zhì)細胞對LPS刺激的應答可能不夠敏感，需要較長時間刺激才能夠上調(diào)炎癥體的相關(guān)組分的表達； 3．Western Blot結(jié)果顯示，L02肝細胞、HepG2肝細胞和肝組織內(nèi)均表達NLRP3炎癥體，其中Quanity One結(jié)果分析顯示乙肝肝組織中NLRP3炎癥體的表達水平較正常肝組織蛋白表達水平明顯升高；不僅如此，內(nèi)源性危險信號ATP刺激活化L02/HepG2胎肝細胞株胞內(nèi)NLRP3炎癥體，活化的炎癥體進一步招募并切割pro-caspase-1，使成生成更多caspase-1活性P10亞基； 4．ELISA結(jié)果顯示，內(nèi)源性危險信號ATP顯著的促進L02胎肝細胞株IL-1β和IL-18分泌，不僅如此，caspase-1特異性阻斷劑Y-VAD-fmk可抑制ATP介導的L02胎肝細胞株IL-1β和IL-18分泌，因此ATP介導的L02胎肝細胞株IL-1β和IL-18分泌依賴肝細胞內(nèi)caspase-1的活化。 三、結(jié)論： 1．L02肝細胞、HepG2肝細胞和肝組織中均表達有NLRP3炎癥體，并且，肝細胞內(nèi)表達的NLRP3炎癥體可識別內(nèi)源性危險信號ATP活化caspase-1，分泌IL-1β和IL-18，說明了肝實質(zhì)細胞內(nèi)表達的NLRP3炎癥體具有識別危險信號啟動炎癥應答的能力。 2.與骨髓來源的Thp-1細胞相比，肝實質(zhì)細胞的炎癥響應能力較弱，在同等程度的危險信號刺激下，L02胎肝細胞株IL-1β的分泌量僅是Thp-1的1/50-1/10，但HepG2肝癌細胞株可達到Thp-1的1/3-1/2，再考慮到肝組織局部的肝細胞和巨噬細胞、樹突狀細胞等細胞的比例，我們認為肝細胞內(nèi)的NLRP3炎癥體具有參與慢性乙型肝炎炎性損傷的可能，但還需要進一步的研究來提供證據(jù)。 3．慢性乙型肝炎肝組織細胞內(nèi)NLRP3、caspase-1和IL-1β的表達較正常肝組織顯著增高，說明肝細胞內(nèi)NLRP3炎癥體可能參與慢性乙型肝炎的疾病進程。綜上，本課題對肝臟實質(zhì)細胞NLRP3炎癥體的表達和炎癥應答能力進行了初步研究，為進一步探究NLRP3炎癥體在CHB疾病進程中發(fā)揮的作用奠定基礎或提供理論線索。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R512.6

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本文編號：1608073