本文選題：上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化　切入點：胰島素樣生長因子1　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：克羅恩病(Crohn's disease, CD)是一種慢性炎性肉芽腫性疾病,病變可累及腸壁全層,肌層過度增厚和腸壁纖維化引起腸腔狹窄或梗阻,是CD患者選擇手術(shù)治療的主要原因。由于現(xiàn)階段尚無有效阻斷腸纖維化病變的治療方法或藥物,因此,尋求腸纖維化的替代療法是臨床迫切需要的。慢性或反復(fù)的炎癥導(dǎo)致慢性或反復(fù)的組織損傷是促使腸纖維化發(fā)生的必要的先決條件。局部浸潤的炎癥細(xì)胞分泌大量炎癥因子、細(xì)胞因子等,引起間質(zhì)細(xì)胞活化、遷移和增殖并合成分泌大量膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc, ECM),過度沉積于腸壁起腸道纖維化。此外,最新研究使用遺傳譜系追蹤技術(shù)(genetic lineage tracing experiments)發(fā)現(xiàn)：在TNBS誘導(dǎo)的CD動物模型中,腸上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,提示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial to mesenchymal transition, EMT)可能也參與了腸纖維化。因此,阻斷成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞的來源及活化,抑制ECM的合成,是阻斷腸纖維化發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵所在。但目前對于ECM合成及EMT的確切細(xì)胞內(nèi)信號機制尚不清楚。近年來,胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)在胃腸道中的作用已引起廣泛關(guān)注。在病理條件下,IGF-1參與腸道炎癥、腫瘤遷移和腸道纖維化過程。TGF-β(transforming growth factor-β)在腸纖維化中的作用已有廣泛的研究,而IGF-1在腸纖維化中的研究則較少,且機制尚不清楚。由于抗炎藥物只能在炎癥階段抑制纖維化的發(fā)生,但是對于已發(fā)生纖維化的病變組織則沒有延緩其進(jìn)展的作用。目前研究顯示,多酚類化合物——白藜蘆醇(resveratrol, RSV)是NAD+依賴性組蛋白去乙�；窼IRT1 (silent mating type information regulation-1)的激動劑。研究表明,RSV可通過激活SIRT1對組蛋白或非組蛋白賴氨酸殘基進(jìn)行去乙�；揎梺碚{(diào)節(jié)基因表達(dá),參與細(xì)胞衰老、凋亡、分化等生理活動。研究報道,在肽聚糖-多糖(PG-PC)誘導(dǎo)的大鼠CD模型中,RSV能降低促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1)、Ⅰ、Ⅲ型前膠原和IGF-1 mRNA表達(dá)。因此,我們進(jìn)一步推測,RSV可能通過激活SIRT1在腸纖維化過程中發(fā)揮保護(hù)作用。第—部分IGF-1對腸上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及機制目的：探討胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)對腸上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用及可能機制。方法：體外培養(yǎng)大鼠腸上皮細(xì)胞株(IEC-6),應(yīng)用real-time PCR和western blot檢測重組大鼠IGF-1對腸上皮細(xì)胞合成e-cadherin和vimentin的劑量效應(yīng)(50、100、150ng/ml)和時間效應(yīng)(24、48、72 h)。用細(xì)胞免疫熒光方法,檢測IGF-1對腸上皮細(xì)胞膜上e-cadherin表達(dá)的影響,并用普通光學(xué)顯微鏡觀察腸上皮細(xì)胞形態(tài)變化。檢測IGF-1對腸上皮細(xì)胞IGF-1受體(IGF-1 receptor,IGF-1R)及下游信號分子Akt、ERK1/2、p38和JNK表達(dá)的時間效應(yīng)(0,5,15,30,60min)。用IGF-1R小干擾RNA沉默IGF-1R表達(dá)后,檢測IGF-1和IGF-1R 和 ERK1/2磷酸化和e-cadherin蛋白表達(dá)的影響。給予MAPK/ERK抑制劑U0126 (50μM)和PI3K/Akt抑制劑LY294002 (20μM),分別用vestern blot和細(xì)胞免疫熒光的方法檢測IGF-1對e-cadherin表達(dá)的影響。結(jié)果：IGF-1呈時間依賴性下調(diào)e-cadherin蛋白表達(dá),上調(diào)vimentin表達(dá)。IGF-1呈劑量依賴降低e-cadherin mRNA水平。光鏡下,正常組腸上皮細(xì)胞呈現(xiàn)連接緊密的骰狀或立方形；IGF-1處理48 h后,細(xì)胞間連接松散,細(xì)胞呈紡錘體形或三角形。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示：較對照組,IGF-1處理后細(xì)胞膜上e-cadherin表達(dá)明顯降低。以上結(jié)果提示IGF-1可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,并呈時間和劑量依賴性下調(diào)e-cadherin表達(dá)。IGF-1可激活腸上皮細(xì)胞內(nèi)IGF-1R, MAPK/ERK1/2, PI3K/Akt信號通路分子的活化,刺激5min時,IGF-1R磷酸化即升高,在30min時升高最顯著；刺激15min,ERK1/2磷酸化水平升高,在30、60min時達(dá)最高；Akt磷酸化水平在30min時有升高；p38和JNK磷酸化水平?jīng)]有顯著改變。提示在腸上皮細(xì)胞中,IGF-1主要激活I(lǐng)GF-1R、MAPK/ERK、PI3K/Akt通路。IGF-1R表達(dá)沉默后,再給予IGF-1處理,IGF-1R和ERK1/2磷酸化水平降低,且e-cadherin表達(dá)升高。給予MEK1/2抑制劑U0126后,與IGF-1處理組相比,e-cadherin表達(dá)明顯回升；而給予P13K抑制劑LY294002后,細(xì)胞膜上e-cadherin表達(dá)沒有回升。上述結(jié)果提示IGF-1可能主要通過MAPK/ERK通路抑制e-cadherin表達(dá)。結(jié)論：IGF-1可能通過IGF-1R/MAPK/ERK通路抑制e-cadherin表達(dá),促進(jìn)腸上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。第二部分IGF-I對腸道成纖維細(xì)胞遷移及合成I型膠原的作用及機制目的：探討IGF-1對腸道成纖維細(xì)胞遷移和合成I型膠原的作用及可能的機制。方法：體外培養(yǎng)人正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞株(CCD-18Co)和原代小鼠腸道成纖維細(xì)胞(]mouse intestinal fibroblasts,MIFs)。(1)在CCD-18Co細(xì)胞中,應(yīng)用細(xì)胞劃痕實驗檢測IGF-1對成纖維細(xì)胞遷移能力作用的時間效應(yīng)(0,6,12,24,48h); western bolt和real-time PCR方法檢測IGF-1對細(xì)胞合成N-cadherin的影響。IGF-1干預(yù)不同時間點,檢測對IGF-1R、MAPK、PI3K/Akt信號通路的影響。給予PI3K/Akt通道抑制LY294002 (50μM或10、20、30μM)和MEK1/2抑制劑U0126 (50μM),檢測對N-cadherin表達(dá)及細(xì)胞遷移能力的影響。(2)通過western blot和 real-time PCR檢測IGF-1對成纖維細(xì)胞合成I型膠原的劑量效應(yīng)(50、100、150ng/ml)和時間效應(yīng)(0,24、48、72 h)。應(yīng)用western blot檢測IGF-1對成纖維細(xì)胞中IGFlR和下游信號分子ERK1/2磷酸化的影響。用MEK1/2抑制劑U0126阻斷MAPK/ERK信號通路后,檢測IGF-1對I型膠原合成的影響。結(jié)果：(1)IGF-1呈時間依賴促進(jìn)腸道成纖維細(xì)胞遷移,并誘導(dǎo)鈣黏附因子N-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)。IGF-1激活I(lǐng)GF-1R、ERK1/2、Akt磷酸化,3Omin作用最明顯。IGF-1對N-cadherin表達(dá)的促進(jìn)作用能夠被LY294002阻斷,而U0126對其無顯著影響。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示,LY294002能顯著抑制IGF-1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞遷移。(2)IGF-I誘導(dǎo)腸道成纖維細(xì)胞合成Ⅰ型膠原呈劑量和時間依賴性。IGF-1可磷酸化IGF-IR和下游信號分子ERK1/2,且MEK1/2抑制劑U0126能阻斷IGF-1促Ⅰ型膠原表達(dá)的作用。提示IGF-1可能通過激活MAPK/ERK信號通路誘導(dǎo)Ⅰ型膠原合成。結(jié)論：(1)IGF-1可能通過PI3K/Akt通路促進(jìn)N-cadherin表達(dá),進(jìn)而增強腸道成纖維細(xì)胞遷移能力。(2)IGF-1/IGF-1R/ERK軸可能是IGF-I誘導(dǎo)腸道成纖維細(xì)胞合成Ⅰ型膠原的主要通路。第三部分 白藜蘆醇在IGF-1誘導(dǎo)腸纖維化中的保護(hù)作用及分子機制目的：探討SIRT1激動劑——白藜蘆醇(resveratrol, RSV)對IGF-1誘導(dǎo)腸道成纖維細(xì)胞合成I型膠原的干預(yù)作用及可能的分子機制。方法：(1)采用2,4,6-三硝酸苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)灌腸制備大鼠克羅恩病模型,通過DAI評分、HE染色和Masson染色驗證成膜,并應(yīng)用western bolt方法檢測腸組織中I型膠原、IGF-1和SIRT1的蛋白水平,免疫組化檢測SIRT1的表達(dá)變化和分布。(2)體外培養(yǎng)原代小鼠腸道成纖維細(xì)胞(MIFs)和人正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞株(CCD-18Co)。在CCD-18Co細(xì)胞中,瞬時轉(zhuǎn)染野生型SIRT1(SIRT1 WT)和酶失活缺失突變型SIRT1(SIRT1 H363Y)質(zhì)粒,應(yīng)用western blot檢測SIRT1對I型膠原表達(dá)的影響。選擇不同濃度RSV(50、100μM)處理MIFs和CCD-18Co細(xì)胞,用western blot 和 real time PCR檢測I型膠原的蛋白和mRNA水平。用特異性SIRT1小干擾RNA (siRNA)沉默SIRT1表達(dá)后,檢測RSV對I型膠原表達(dá)的影響。Western blot方法檢測給予RSV或過表達(dá)SIRT1 WT后,IGF-1/-IGF-1R/ERK軸信號分子磷酸化水平的變化。結(jié)果：(1)在TNBS誘導(dǎo)的大鼠克羅恩病腸纖維化模型中,TNBS組出現(xiàn)明顯炎癥和纖維化改變,且I型膠原和IGF-1表達(dá)較對照組顯著升高,而SIRT1蛋白水平明顯降低(0.67±0.04 vs 1.05±0.07,P0.001)。免疫組化結(jié)果顯示,對照組SIRT1染色陽性細(xì)胞主要分布于粘膜肌層和固有肌層,粘膜固有層隱窩處和粘膜下層也有分布,且SIRT1主要定位于細(xì)胞胞漿；軟件分析SIRT1染色陽性區(qū)域的積分光密度/面積(IOD/area)比值,TNBS組比值較對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)在成纖維細(xì)胞中,過表達(dá)SIRT1可降低I型膠原的表達(dá),而SIRT1酶失活突變型質(zhì)粒無明顯作用。RSV能降低基礎(chǔ)和IGF-1誘導(dǎo)下的I型膠原的合成。SIRT1干擾沉默后阻斷了RSV對I型膠原合成的抑制作用。(3)RSV可抑制IGF-1誘導(dǎo)下IGF-1R和下游信號分子ERK1/2的磷酸化,但是過表達(dá)SIRT1對IGF-1R磷酸化沒有影響,且SIRT1干擾后,RSV仍然能抑制IGF-1誘導(dǎo)下的I型膠原表達(dá)。結(jié)論：(1)動物模型中,病變腸組織中SIRT1水平降低可能參與腸纖維化。(2)體外細(xì)胞實驗,證實RSV單獨作用可能通過激活SIRT1抑制I型膠原的合成,且可能與S1RT1的去乙酰化酶活性有關(guān)。(3)RSV可抑制IGF-1誘導(dǎo)下I型膠原的合成,其機制可能是通過抑制IGF-1R磷酸化,進(jìn)而抑制下游促膠原合成的MAPK/ERK信號通路,且該作用不依賴于SIRT1。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R574.62

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本文編號：1594733