本文關(guān)鍵詞： 終末期肝病 人毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞 干細(xì)胞分化 誘導(dǎo)性肝細(xì)胞 低氧微環(huán)境　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:終末期肝病是一種由多種因素如病毒感染等引起的進(jìn)行性不可逆的肝臟損傷,最終將發(fā)展至肝功能顯著減退乃至肝衰竭。迄今為止,終末期肝病治療效果最好的方法仍然是進(jìn)行肝移植,但肝移植的臨床應(yīng)用卻面臨著諸多局限,比如昂貴的費(fèi)用,長期服用免疫抑制劑伴隨的副作用,以及目前器官移植的最大瓶頸——供肝來源有限。因此,開發(fā)出能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)器官移植治療終末期肝病的新療法已經(jīng)成為亟需解決的問題。干細(xì)胞(stem cell)是一種能夠維持自我更新的狀態(tài)、保持高度增殖能力、具有向任何機(jī)體組織、器官細(xì)胞分化的潛能,并保持自身不發(fā)生分化的一類細(xì)胞。理論上,干細(xì)胞能夠分化為任何組織細(xì)胞,因此利用自身干細(xì)胞衍生的組織或器官替代病變的組織和器官已成為器官移植、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域最有希望的新型治療手段。與傳統(tǒng)肝臟移植手術(shù)不同的是,干細(xì)胞移植治療終末期肝病具有治療花費(fèi)少、取材途徑多樣并且沒有免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。目前已有多項研究表明,胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞以及誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)均能在體外經(jīng)特定因子刺激下定向分化為具有糖原合成、藥物代謝等成熟肝細(xì)胞功能的肝樣細(xì)胞。近年,我們已經(jīng)成功從人毛囊組織中分離出人毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞(hair follicle mesenchymal stem cell,HF-MSC),并利用慢病毒將Yamanaka四因子導(dǎo)入HF-MSC中,在國內(nèi)外首次成功構(gòu)建了人毛V⒓涑渲試蔥詉 PS細(xì)胞(HF-iPSC)。具備全向分化潛能的HF-iPSC一方面能夠利用HF-MSC無需手術(shù)等優(yōu)點(diǎn),另一方面可維持其未分化狀態(tài),長時間進(jìn)行體外培養(yǎng)時HF-iPSC的基因組具有更好的穩(wěn)定性。目前,尚未有相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HF-iPSC是否能在體外成功分化為具有成熟肝細(xì)胞功能的誘導(dǎo)性肝細(xì)胞(induced hepatocyte-like cell,i Hep)。另外,雖然研究顯示通過直接移植干細(xì)胞或由干細(xì)胞體外誘導(dǎo)獲得的肝細(xì)胞來治療終末期肝病在一定程度上能夠改善肝功能以及延長終末期肝病模型小鼠的生存時間,但植入的干細(xì)胞或誘導(dǎo)性肝細(xì)胞究竟如何在病理環(huán)境下分化、增殖和發(fā)揮功能卻并不十分明確。因此,針對在終末期肝病中普遍存在的低氧微環(huán)境,系統(tǒng)研究干細(xì)胞在低氧環(huán)境下的分化、增殖等過程將為我們更明確的掌握移植細(xì)胞對體內(nèi)低氧微環(huán)境的應(yīng)答、更有效的發(fā)揮移植干細(xì)胞的修復(fù)功能提供理論基礎(chǔ)。目的:本研究以人毛V⒓涑渲試蔥詉PSC為種子細(xì)胞,探討在體外誘導(dǎo)HF-iPSC向功能性肝細(xì)胞分化的可能性,以期在對終末期肝病進(jìn)行細(xì)胞治療的干細(xì)胞種子庫中再添加一個新的選擇。同時,針對在終末期肝病中普遍存在的低氧環(huán)境,我們研究低氧培養(yǎng)對HF-iPSC分化能力的影響,這為我們進(jìn)一步明確如何在低氧環(huán)境下更有效的發(fā)揮干細(xì)胞的修復(fù)功能提供理論基礎(chǔ)。方法:本研究采用“定型內(nèi)胚層-肝臟特化-肝祖細(xì)胞增殖-肝細(xì)胞成熟”4階段誘導(dǎo)方案,通過在肝細(xì)胞發(fā)育的各個階段中添加不同類型的刺激因子誘導(dǎo)HF-iPSC在體外分化為肝細(xì)胞;通過免疫熒光染色和實(shí)時熒光定量PCR方法對干細(xì)胞多能性基因、分化相關(guān)的標(biāo)志性基因和肝細(xì)胞特異性基因進(jìn)行鑒定并應(yīng)用基因芯片技術(shù)對誘導(dǎo)細(xì)胞的基因表達(dá)情況進(jìn)行分析;同時,我們還對獲得的誘導(dǎo)性肝細(xì)胞進(jìn)行了糖原攝取、藥物代謝等功能方面相關(guān)的驗(yàn)證。結(jié)果:1.HF-iPSC經(jīng)體外20天誘導(dǎo)分化后,獲得的誘導(dǎo)性肝細(xì)胞能夠表達(dá)白蛋白(albumin,ALB)、甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、CYP450家族中的CYP3A4、CYP7A1等肝細(xì)胞特異表達(dá)的基因,并具有糖原攝取等成熟肝細(xì)胞功能。2.短暫低氧誘導(dǎo)能夠顯著上調(diào)定型內(nèi)胚層的標(biāo)志性基因SOX17(SRY-Box 17)、GATA4(GATA-binding Protein 4)和Fox A2(Forkhead box A2)的表達(dá),下調(diào)多能性相關(guān)基因SOX2、OCT4的表達(dá);長期低氧誘導(dǎo)時,SOX17、GATA4和Fox A2表達(dá)水平也上升,但較短暫低氧組表達(dá)水平偏低,并且干細(xì)胞多能性相關(guān)基因SOX2和OCT4表達(dá)呈上升趨勢。結(jié)論:1.人毛囊間充質(zhì)源性iPSC可通過在不同肝分化階段添加不同的刺激因子成功在體外獲得具有糖原攝取、低密度脂蛋白攝取等成熟肝細(xì)胞功能的誘導(dǎo)性肝細(xì)胞,這使HF-iPSC成為有希望治療終末期肝病的干細(xì)胞庫中的一個新成員,為應(yīng)用HF-iPSC進(jìn)行再生醫(yī)學(xué)探索及疾病的個體化治療奠定理論基礎(chǔ)。2.短暫低氧能夠促進(jìn)HF-iPSC向定型內(nèi)胚層分化,而長期低氧則對HF-iPSC的分化能力有一定抑制作用。明確短暫低氧和長期低氧對干細(xì)胞分化的作用差異將對我們提高干細(xì)胞分化效率以及探討如何更有效的使干細(xì)胞在低氧環(huán)境下發(fā)揮肝臟修復(fù)功能有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575.3

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本文編號：1512799