發(fā)布時(shí)間：2018-02-13 22:41

  本文關(guān)鍵詞： Caveolin-1 酒精性肝損傷 狂飲 誘導(dǎo)型一氧化氮復(fù)合酶 ONOO~-　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景酗酒在全世界范圍內(nèi)作為一種習(xí)慣而普遍存在,其影響和危害目前已被公認(rèn)。酗酒已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)疾病和殘疾的第三大誘因,導(dǎo)致最常見的癥狀是慢性酒精中毒,其可能誘發(fā)多達(dá)60多種疾病,不僅對個(gè)人的身體健康有很大影響,同時(shí)亦造成嚴(yán)重的社會后果�？駳g性飲酒作為普遍流行于男性年輕人群體中的一種特殊的飲酒模式,同長期慢性飲酒模式共同參與了多數(shù)酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展過程中,但其作用機(jī)制仍有待深入。酒精通過激活氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)氧族與氮族自由基增多,是酒精性肝細(xì)胞損傷的重要作用機(jī)制之一。這一過程中大量產(chǎn)生的自由基:超氧陰離子(02-)、過氧化氫(H202)、羥自由基CO(OH-)、一氧化氮(NO)和乙氧自由基(C2H50-)等,不僅激活磷脂酶及脂質(zhì)過氧化反應(yīng),還影響遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能造成肝細(xì)胞損傷。此外,NO對線粒體呼吸的抑制作用對肝臟代謝具有重要影響。NO和O2-結(jié)合產(chǎn)生的過氧亞硝酸基陰離子(ONOO-),是一種強(qiáng)氧化劑和細(xì)胞毒性物質(zhì),能夠直接引起細(xì)胞的損傷與凋亡。研究表明NO主要是通過三種一氧化氮復(fù)合酶(eNOS、nNOS和iNOS)誘導(dǎo)產(chǎn)生,而NOS的生物結(jié)構(gòu)中存在Caveolin-1(Cav-1)結(jié)合基序(OXOXXXXO,or OXXOXXXXO),能夠被 Cav-1 的腳手架結(jié)構(gòu)蛋白(Caveolin-scaffolding domain,CSD)結(jié)合。Cav-1作為NOS的重要調(diào)控蛋白,在氮自由基損傷的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。Cav-1,是小窩膜上重要的一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(21-24 KD),調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)等生理功能。它可以通過與NOS直接結(jié)合的方式調(diào)節(jié)三種類型的NOS。研究表明,Cav-1基因敲除小鼠的心臟中eNOS和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白水平均顯著性上調(diào)。我們的研究團(tuán)隊(duì)先前已報(bào)道在神經(jīng)細(xì)胞中Cav-1和NO之間的負(fù)相關(guān)調(diào)控機(jī)制。目前,關(guān)于Cav-1在其他肝臟疾病中有一定的研究,但是在酒精性肝損傷,特別是由不同的飲酒習(xí)慣所導(dǎo)致的損傷發(fā)生發(fā)展的機(jī)制中,Cav-1的病理生理作用仍有待深入探究�，F(xiàn)代新藥的發(fā)現(xiàn)競爭的焦點(diǎn)在于靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與證實(shí)以及供篩選的庫,傳統(tǒng)中藥由于擁有幾千年長期臨床經(jīng)驗(yàn)的積累,在新藥的研究中擁有廣闊的前景,如何在龐大的中藥資源中篩選出有針對性和特異性的中藥成分,并結(jié)合生物靶點(diǎn)的研究基礎(chǔ)去探究中藥靶標(biāo)治療的理念,或許能促進(jìn)中醫(yī)藥理論的進(jìn)一步深化,并為中醫(yī)藥在全球的進(jìn)一步推廣提供科研依據(jù)。在這項(xiàng)研究中我們通過體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)(基因敲除小鼠)、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及人體臨床實(shí)驗(yàn)深入探索了 Cav-1在急慢性飲酒引起的肝損傷發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。為Cav-1在狂飲過程中以及長期慢性飲酒誘導(dǎo)肝損傷中的作用提供了理論基礎(chǔ)和臨床依據(jù)。同時(shí)我們嘗試篩選出針對Cav-1調(diào)控的特異性中藥單體,為中藥靶標(biāo)治療理念在酒精性肝損傷的治療和運(yùn)用提供分子生物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法:1.動物實(shí)驗(yàn)本課題中動物實(shí)驗(yàn)方案由香港大學(xué)動物倫理中心批準(zhǔn)。同窩對照的雄性Cav-1 基因敲除小鼠(Cav-1~(-/-)mice,strain Cav-1tmlMls/J,Jackson Laboratory,USA),Cav-1基因雜合子小鼠(Cav-1~(+/-))以及野生型正常小鼠(WT,Cav-1+/+)鑒定后在8-12周齡被用于模型建立。1.1.急性狂歡性飲酒動物模型建立狂歡性飲酒(Binge drinking,狂飲或豪飲)模型:小鼠禁食不禁水6h后,用50%(vol/vol)酒精按照飲酒總量5g/kg體重的劑量灌胃。對照組以等體積的水溶液灌胃。平行干預(yù)實(shí)驗(yàn)中,在狂飲模型建立的30分鐘前給予小鼠iNOS抑制劑 N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidine(1400W;5 mg/kg,ip.)。1.2.慢性酒精性肝損傷動物模型建立將6-8周的雄性野生型及Cav-1~(-/-)小鼠喂養(yǎng)Lieber-deCarli液體詞料,3天后隨機(jī)分為四組:野生型小鼠對照液態(tài)飼料喂養(yǎng)組和酒精液態(tài)詞料喂養(yǎng)組;Cav-1~(-/-)小鼠對照液態(tài)飼料喂養(yǎng)組和酒精液態(tài)詞料喂養(yǎng)組。酒精組小鼠喂養(yǎng)梯度濃度的酒精,1%和2%(vol/vol)各自喂養(yǎng)2天,3%喂養(yǎng)3天,而后5%酒精喂養(yǎng)7周。對照組全程喂養(yǎng)等卡路里液體詞料。1.3.慢性酒精性肝損傷動物模型柚皮苷處理組小鼠慢性酒精性肝損傷模型建立第3周后開始以200mg/kg/d的劑量對小鼠流質(zhì)飲食中添加柚皮苷,持續(xù)4周。1.4.實(shí)驗(yàn)動物樣品制備各組小鼠模型完成后,用200mg/kg戊巴比妥麻醉小鼠,經(jīng)心臟采血,分離血清,-80℃保存?zhèn)溆?用于檢測血清Cav-1水平、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT/AST)、NO水平、NOS 水平(總復(fù)合酶活性及iNOS活性)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(Catalase)活性、谷胱甘肽(GSH)活性及表達(dá)、游離脂肪酸(Free fatty acids,FFA)及甘油三酯(Triglycerides,TC)水平。然后通過心臟灌注將小鼠體內(nèi)的血液排除,取出小鼠肝臟,觀察其大體形態(tài),并于肝左葉中部取新鮮肝組織4%PFA固定后行病理切片處理(冰凍切片和石蠟切片),HE染色及各種免疫組化檢測,觀察肝臟組織病理學(xué)變化,同時(shí)檢測肝組織中Cav-1及相關(guān)蛋白的表達(dá),以及用TUNEL檢測肝細(xì)胞凋亡情況;同時(shí)取相鄰部位肝組織肝組織勻漿,用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot),檢測肝組織中Cav-1及相關(guān)蛋白的表達(dá)改變,同時(shí)檢測肝臟中一氧化氮復(fù)合酶水平、ADH、Catalase、GSH及SOD活性;另取一部分肝組織液氮速凍后保存,以提取小鼠肝臟總RNA,用于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)及Real-time PCR反應(yīng)檢測Cav-1、炎癥因子的mRNA水平。1.5.ONOCT熒光探針實(shí)驗(yàn)COMPOUND 14(專利號:WO2013113279A1),是由香港大學(xué)化學(xué)系最新研制成功的一種針對ONOO-特異性結(jié)合的紅色熒光探針,具有極其強(qiáng)烈的探測ONOO-敏感性及選擇性。小鼠狂飲模型建立后3h,對麻醉后的狂飲小鼠肝臟進(jìn)行 ONOO-探針溶液 COMPOUND 14(1 mM/mice liver;Perfusion rate:2 ml/min,total25 ml)的灌注后,急速冷凍做成冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察并記錄。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)人源正常肝細(xì)胞株L02購自中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞庫。常規(guī)培養(yǎng)傳代后,建立酒精性損傷細(xì)胞模型。用100mM、200mM酒精處理L02細(xì)胞24小時(shí)后,提取細(xì)胞蛋白,Western blot檢測在酒精干預(yù)下肝細(xì)胞Cav-1表達(dá)的時(shí)間及濃度效應(yīng);使用ERK1/2抑制劑PD98059以及STAT3抑制劑SD-1029分別干預(yù)L02細(xì)胞,24小時(shí)后觀察Cav-1的改變情況;用Cav-1小分子干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞誘導(dǎo)Cav-1的沉默,觀察Cav-1相關(guān)蛋白的改變情況。3.人體臨床試驗(yàn)本臨床試驗(yàn)采用隨機(jī)、平行、對照試驗(yàn)設(shè)計(jì),共有65名年齡為21-35歲健康無長期飲酒史的健康男性受試者。為達(dá)到狂飲(Binge drinking)模型的要求,飲酒組需要在2h內(nèi)飲用5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)杯的白酒(一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)杯相當(dāng)于14g酒精),對照組2h內(nèi)飲用同等體積的水溶液。本臨床試驗(yàn)通過了南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合倫理委員會的批準(zhǔn),批準(zhǔn)編號[2013]倫理字(001)號,并在中國臨床試驗(yàn)注冊中心Chinese Clinical Trial Registry注冊并審gü，

本文編號：1509268