本文關鍵詞： 肝再生 肝臟干細胞 Wnt/β-catenin信號通路 非經(jīng)典Wnt信號通路　出處：《重慶醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景:肝臟在生物體內(nèi)具有重要的代謝、外分泌和內(nèi)分泌等多重功能,肝臟的生理功能異�？梢詫е缕涓咚劳雎省８闻K是高度再生的器官,在損傷期間可依賴所含干細胞被激活,通過自我復制完全恢復功能。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號在肝再生發(fā)育過程中,參與調(diào)節(jié)胎肝細胞的增殖和分化。但是,可能的非經(jīng)典Wnt信號通路在這個過程中所起作用尚不清楚。目的:探討非經(jīng)典Wnt信號在經(jīng)典Wnt信號通路參與的小鼠肝臟發(fā)育中,對胎肝細胞的增殖,干性及終末分化所起的作用。方法:首先我們在不同發(fā)育階段(出生后0D,14D,28D,180D)的小鼠肝臟組織中,運用Real-time PCR檢測已知的所有經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號通路各組份的表達量。然后以可逆性永生化小鼠胎肝細胞系i HPx為實驗對象,Real-time PCR檢測Wnt信號通路各組分的表達情況。構建重組腺病毒過表達經(jīng)典Wnt 1,2,3,3a,6,7a。β-catenin/TCF4/LEF螢光素酶活性報告基因TOP-luc用于檢測經(jīng)典Wnt1,2,3,3a,6,7a在i HPx細胞中對經(jīng)典通路下游的激活情況。構建重組腺病毒過表達非經(jīng)典Wnt 5a,9b,10a,10b,利用TOP-luc檢測非經(jīng)典Wnt5a,9b,10a,10b在i HPx細胞中與經(jīng)典Wnt信號通路的作用。Real-time PCR檢測非經(jīng)典Wnt5a,9b,10a,10b刺激i HPx后,經(jīng)典Wnt信號通路下游基因表達量的變化,以及小鼠肝干性標志物、終末成熟分化標志物和肝臟分化特異性標志物的表達量變化。WST-1實驗檢測不同Wnt對i HPx細胞增殖的影響。白蛋白報告基因Alb-reporter檢測不同Wnt對i HPx細胞成熟分化的影響�？紤]到i HPx細胞內(nèi)永生化基因SV40T對實驗結果的影響,利用重組腺病毒Ad Cre,對SV40T基因進行敲除,Real-time PCR檢測刺激在SV40T敲除i HPx細胞中,過表達非經(jīng)典Wnt5a,9b,10a,10b后,小鼠肝臟干性標志物、終末成熟分化標志物和肝臟分化特異性標志物的表達量變化。吲哚菁綠攝取實驗(ICG)與過碘酸-希夫式反應/糖元儲存實驗(PAS)檢測胎肝細胞在過表達Wnt3a,5a,9b,10a,10b以后的分化成熟程度。在i HPx細胞中過表達Wnt3a,5a,9b,10a,10b后,行裸鼠皮下異位瘤實驗,對皮下包塊行切片后HE染色及免疫組化,觀察不同Wnt對i HPx細胞增殖及分化的影響,已經(jīng)對經(jīng)典通路關鍵因子β-catenin表達量的影響。結果:1.Real-time PCR結果顯示在小鼠不同發(fā)育階段(出生后0D,14D,28D,180D)的肝組織中,經(jīng)典Wnt蛋白除Wnt7a外,均可被檢測,晚期尤甚。非經(jīng)典Wnt蛋白Wnt9b,10a,10b表達顯著增高,與時間成正相關,在出生后28D達到頂峰。各受體、聯(lián)合受體、受體拮抗劑、信號通路相關因子表達量與時間關系也各不相同。在去或不去SV40T的i HPx細胞中(GFP為對照組),相較于其它Wnt,非經(jīng)典Wnt5a,9b,10a,10b以及經(jīng)典Wnt3a依舊顯著高表達,其余信號通路各組分表達與小鼠肝組織中的表達量情況大致相似。此部分結果提示,在小鼠肝發(fā)育過程中,除經(jīng)典Wnt信號通路外,高表達的非經(jīng)典Wnt5a,9b,10a,10b也可能參與其中。2.在i HPx細胞內(nèi)分別過表達所有經(jīng)典Wnt1,2,3,3a,6,7a,利用螢光素酶活性報告基因TOP-luc對的β-catenin/TCF4/LEF的活性檢測進行檢測,結果顯示經(jīng)典Wnt均可以激活i HPx細胞內(nèi)的β-catenin/TCF4/LEF通路。挑選Wnt3a作為經(jīng)典Wnt代表在i HPx細胞內(nèi)過表達以后,聯(lián)合分別過表達非經(jīng)典Wnt5a,9b,10a,10b,β-catenin/TCF4/LEF的活性被抑制。在i HPx細胞內(nèi)過表達Wnt5a,9b,10a,10b以后,Real-time PCR檢測經(jīng)典Wnt信號通路下游靶基因Axin2,Sox9d等的表達被抑制。以上結果提示:非經(jīng)典Wnt5a,Wnt9b,Wnt10a和Wnt10b蛋白在小鼠肝發(fā)育過程中,具有微調(diào)經(jīng)典Wnt蛋白抑制β-catenin/TCF4/LEF活性的作用。3.在i HPx細胞過表達Wnt3a,5a,9b,10a和10b以后,與GFP對照組相比,WST-1結果表明Wnt3a在不同時間點可促進i HPx細胞的增殖,而Wnt5a,9b,10a和10b抑制i HPx細胞的增殖。Real-time PCR結果提示在過表達非經(jīng)典Wnt5a,9b,10a,10b以后,i HPx細胞內(nèi)大部分干性相關基因被抑制,肝臟成熟相關基因表達增高。在含有白蛋白螢光素酶報告基因的i HPx-Alb reporter-luc細胞系內(nèi),過表達Wnt5a,9b,10a和10b以后,白蛋白的表達量亦增加。ICG和PAS實驗結果提示過表達Wnt3a后,與GFP對照組相比無明顯差異,而過表達Wnt5a,9b,10a和10b后,與GFP對照組相比i HPx細胞攝取吲哚菁綠和儲存糖原的能力增強。該部分結果提示:經(jīng)典Wnt3a可以促進i HPx細胞的增殖,而Wnt5a,Wnt9b,Wnt10a和Wnt10b可抑制細胞增殖,同時促進i HPx細胞的成熟分化。4.在去除SV40T的去永生化i HPx細胞中,Real-time PCR結果提示SV40T促進干性相關基因的表達,抑制成熟肝相關基因的表達。在去除SV40T的i HPx細胞中過表達Wnt5a,9b,10a,10b后,Real-time PCR結果提示i HPx細胞干性相關基因被抑制,成熟肝相關基因高表達。去除SV40T的i HPx細胞內(nèi)過表達不同Wnt,ICG實驗與PAS實驗結果與前一致。該部分結果提示:永生化基因SV40T可維持i HPx細胞干性,抑制其成熟分化,去或不去永生化后的i HPx細胞,不同Wnt信號對其作用并無明顯差異。5.在不同Wnt刺激的i HPx細胞裸鼠皮下成瘤試驗中,HE染色結果提示,過表達Wnt3a實驗組的i HPx細胞,細胞核大深染,細胞質(zhì)少且淡然,細胞生長狀態(tài)較5a,9b,10a,10b組旺盛。免疫組化結果提示,Wnt3a實驗組PCNA陽性著色顯著高于GFP實驗組,而Wnt5a,9b,10a,10b實驗組陽性著色低于GFP組。β-catenin陽性著色在Wnt3a組顯著高于GFP對照組,而Wnt5a,9b,10a,10b實驗組的陽性著色低于GFP對照組,提示經(jīng)典Wnt3a激活β-catenin,而經(jīng)典Wnt5a,9b,10a,10b抑制β-catenin活性。該部分實驗結果提示,在體內(nèi)過表達Wnt3a可激活經(jīng)典β-catenin通路刺激i HPx細胞的增殖,而Wnt5a,9b,10a,10b抑制經(jīng)典β-catenin通路抑制i HPx細胞的增殖綜上所述,非經(jīng)典Wnt蛋白5a,9b,10a,10b在經(jīng)典Wnt3a參與的調(diào)節(jié)小鼠肝發(fā)育過程中,抑制肝干細胞的增殖與干性,促進肝干細胞的終末分化。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R575

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