本文關(guān)鍵詞：布拉氏酵母菌對NAFLD小鼠肝臟脂肪變及腸道菌群變化的初步研究

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【摘要】：目的:1建立非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的動物模型;2予布拉氏酵母菌散劑灌胃進(jìn)行干預(yù),觀察肝臟組織病理學(xué)、生化指標(biāo)、蛋白表達(dá)、免疫學(xué)及腸道菌群變化,初步探討布拉氏酵母菌對小鼠NAFLD的療效及作用機(jī)制。方法:1 38只雄性C57BL/6小鼠,6~8周齡,自由攝食AIN93對照飼料7天后,隨機(jī)分為Control組及西方飲食(Western diet,WD)組,Control組16只,WD組22只。分別給予對照飲食及西方飲食(高脂肪高糖飲食),造模時間33周。33周后從WD組中隨機(jī)抽取12只小鼠,分為布拉氏酵母菌灌胃組(TB,n=6)及灌胃對照組(TD,n=6),分別給予布拉氏酵母菌(5.98×108 CFU/kg/day)及果糖(284mg/kg/day)+乳糖(19mg/kg/day)灌胃,每日1次,共灌胃6周,6周后處死小鼠。2定期觀察小鼠的進(jìn)食、精神狀態(tài)及毛發(fā)光澤度等,每周稱量小鼠體重并記錄。3觀察各組小鼠肝臟外形變化,記錄肝重,計算并比較肝重指數(shù)。4應(yīng)用蘇木素-伊紅(Hematoxylin and eosin,HE)染色觀察肝組織病理學(xué)的改變。5檢測布拉氏酵母菌干預(yù)前后血清甘油三酯(Triglyceride,TG)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST)及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)及內(nèi)毒素的變化情況。6應(yīng)用實時熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitation PCR,Real-time QPCR)方法檢測布拉氏酵母菌干預(yù)前后肝組織中α-平滑肌肌動蛋白(Alpha-smooth muscle actin,α-SMA)m RNA、轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)m RNA、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)m RNA的表達(dá)情況。7提取肝、脾組織中的淋巴細(xì)胞行流式細(xì)胞學(xué)檢測,了解布拉氏酵母菌干預(yù)前后肝、脾組織中CD4+/CD8+比值、CD4+T細(xì)胞IL-17、RORγt的表達(dá)情況。8應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測布拉氏酵母菌干預(yù)前后肝臟組織中α-SMA及TNF-α的表達(dá)情況。9應(yīng)用16s r RNA宏基因組測序的方法了解布拉氏酵母菌干預(yù)后小鼠腸道菌群的變化情況。結(jié)果:1西方飲食喂養(yǎng)C57BL/6雄性小鼠33周后行肝臟HE染色:Control組肝臟肝細(xì)胞大小及排列正常,WD組可見彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性,有炎癥細(xì)胞浸潤,造模成功。灌胃后,與TD組比較,TB組肝臟脂肪變程度及炎癥程度減輕,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2與Control組比較,WD組血清中ALT、AST及TG均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);同TD組比較,TB組血清中ALT、AST及TG均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3 Real-time QPCR:與Control組比較,WD組TGF-β、TNF-α、α-SMA m RNA的表達(dá)量增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),TB組較TD組TNF-αm RNA表達(dá)量減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而TD組及TB組之間TGF-βm RNA、α-SMA m RNA均無明顯變化(P0.05)。4血清IL-17:與Control組比較,WD組IL-17表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與TD組比較,TB組IL-17的表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5血清內(nèi)毒素:WD組內(nèi)毒素水平較Control組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與TD組比較,TB組內(nèi)毒素水平下降(P0.05)。6流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果示:肝臟:與Control組比較,WD組CD4+/CD8+、CD4+T RORγt的表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),CD4+T IL-17表達(dá)量未見明顯差異(P0.05),同TD組比較,TB組CD4+/CD8+、CD4+T RORγt表達(dá)量下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),CD4+T IL-17的表達(dá)量未見明顯差異(P0.05);脾臟:CD4+/CD8+、CD4+T RORγt、CD4+T IL-17表達(dá)量WD組與Control組之間,TB組與TD組之間均未見明顯變化(P0.05)。7免疫組化:α-SMA:與Control組比較,WD組α-SMA表達(dá)量增高(P0.05);布拉氏酵母菌干預(yù)后,TB組及TD組未見明顯變化(P0.05);TNF-α:與Control組比較,WD組表達(dá)量增高(P0.05),同TD組比較,TB組表達(dá)下降(P0.05)。8 16s r RNA宏基因組測序:布拉氏酵母菌干預(yù)后TB組較TD組增多的有:厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門(Actinobacteria),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),TB組較TD組減少的有:擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),含量較多的前15種菌群中其余菌群未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:1通過采用經(jīng)典的西方飲食,成功建立了NAFLD小鼠模型。2布拉氏酵母菌可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮對NAFLD的治療作用。3布拉氏酵母菌可能通過下調(diào)肝臟淋巴細(xì)胞內(nèi)CD4+/CD8+比值在NAFLD中發(fā)揮治療作用。4布拉氏酵母菌可能通過下調(diào)肝臟淋巴細(xì)胞內(nèi)CD4+T RORγt的表達(dá)在NAFLD中發(fā)揮治療作用。5布拉氏酵母菌可能通過抑制內(nèi)毒素、TNF-α、IL-17的表達(dá)在NAFLD中發(fā)揮治療作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.5

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本文編號：1303307