本文關(guān)鍵詞：膽汁淤積時白介素18對MRP2的調(diào)節(jié)作用及其分子機制研究

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【摘要】：膽汁淤積是臨床常見的綜合征,是指膽汁的合成、排泄過程發(fā)生障礙,導(dǎo)致膽汁成分在肝細(xì)胞中堆積,進一步導(dǎo)致血液中膽汁成分的含量升高。肝臟是膽汁酸、膽紅素等合成、分泌、排泄及其再循環(huán)的重要器官。膽汁酸代謝要維持平衡,主要依賴于膽汁酸的攝取和排泄實現(xiàn)相對平衡;為了完成這種生理需要,肝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了一套精細(xì)的膽汁酸攝取和排泄系統(tǒng),由一系列分布于基底膜或小管側(cè)膜上的功能不同的轉(zhuǎn)運蛋白構(gòu)成,如有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽(organic anion transporter polypeptides,OATPs),膽鹽輸出泵(bile salt export pump,BSEP),鈉離子-�；悄懼峁厕D(zhuǎn)運蛋白(sodium/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP),多耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated proteins,MRPs)等。這些轉(zhuǎn)運蛋白分布于肝細(xì)胞膜的不同部位,它們互相協(xié)調(diào),分工合作,對膽汁的形成、維持膽汁酸正常代謝、平衡,實現(xiàn)其生理功能并抵御膽汁酸毒性損傷起到重要的生理作用。目前認(rèn)為,膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白的異常改變可能是膽汁淤積發(fā)生、發(fā)展的重要分子機制。多耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)是具有ATP結(jié)合域的盒式跨膜轉(zhuǎn)運子蛋白超家族(ATP binding cassette transporter proteins superfamily)中C亞族成員,它主要位于肝細(xì)胞膜表面,此外在腎臟、大腸、小腸等器官組織中也有表達(dá)。在肝臟,MRP2主要位于肝細(xì)胞的頂膜側(cè),亦即小管側(cè),它是膽汁轉(zhuǎn)運、代謝中的一個重要蛋白,主要生理作用是向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運有機陰離子復(fù)合物,其重要轉(zhuǎn)運底物為結(jié)合膽紅素,其次還有二價的硫酸鹽、谷胱甘肽、其它葡萄糖醛酸結(jié)合物以及多種藥物。MRP2的功能障礙可導(dǎo)致血液內(nèi)膽紅素的堆積,在人體可表現(xiàn)為Dubin-Johnson綜合征。因此MRP2是維持膽汁酸代謝平衡中非常重要的一個跨膜轉(zhuǎn)運蛋白。正常生理狀態(tài)下,肝組織的MRP2處于高表達(dá)狀態(tài),以維持正常膽汁酸代謝的需要。而且已知的直接調(diào)控MRP2轉(zhuǎn)錄水平的核受體對其均為正向調(diào)控,及促進MRP2的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。但許多人體和動物研究中均發(fā)現(xiàn),當(dāng)發(fā)生膽汁淤積時,MRP2的表達(dá)是明顯降低的,而其分子機制尚不明確。膽汁淤積時伴有許多炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子水平的升高,如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)6等,許多研究也提示這些炎癥因子不僅是繼發(fā)于膽汁淤積的炎癥反應(yīng),同時也對肝細(xì)胞膜表面的各種膽汁酸轉(zhuǎn)運體具有調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)膽道梗阻時il-18表達(dá)水平增高,解除梗阻后il-18水平可回復(fù);另有研究發(fā)現(xiàn)在壞死性腸炎動物模型中il-18和肝臟mrp2可能存在負(fù)相關(guān)。這些研究結(jié)果提示il-18可能對mrp2的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用,但尚無研究證實并闡述機制。本研究擬從hepg2細(xì)胞及大鼠兩個水平探討il-18在調(diào)節(jié)mrp2表達(dá)中的作用及分子機制。主要的研究方法與結(jié)果1.hepg2細(xì)胞中il-18通過nf-κb/fxr/yy1通路下調(diào)mrp2的表達(dá)。以il-18刺激人肝癌細(xì)胞株hepg2,以實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timequantitativepolymerasechainreaction,real-timeqpcr)和westernblot的方法檢測hepg2細(xì)胞mrp2、核因子kappab(nuclearfactorkappab,nf-κb)、法尼酯x受體(farnesoidxreceptor,fxr)、轉(zhuǎn)錄因子陰陽1(yinyang1,yy1)表達(dá)量的變化;再以nf-κbp65亞基的短發(fā)夾rna(shorthairpinrna,shrna)及yy1shrna轉(zhuǎn)染hepg2細(xì)胞,觀察p65及yy1基因干擾對il-18誘導(dǎo)的mrp2、fxr、yy1表達(dá)變化的影響。1.1以il-18刺激體外培養(yǎng)的hepg2細(xì)胞,用real-timeqpcr及蛋白質(zhì)印記(westernblot)方法檢測mrp2的mrna表達(dá)水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平,確定il-18對mrp2的具有下調(diào)作用,且呈劑量與時間依賴關(guān)系。1.2確定在hepg2細(xì)胞中il-18可以下調(diào)mrp2表達(dá)后,再以westernblot方法檢測篩選il-18刺激后存在顯著差異性表達(dá)并可調(diào)控mrp2轉(zhuǎn)錄的核因子,篩選后發(fā)現(xiàn)fxr在il-18刺激后有顯著的降低;進一步以不同濃度的il-18刺激hepg2細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),fxr表達(dá)的降低與il-18呈劑量依賴關(guān)系,提示il-18可抑制fxr的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。而fxr已被明確證實可促進mrp2的轉(zhuǎn)錄,fxr的抑制可能導(dǎo)致了mrp2的抑制。但因為調(diào)控mrp2表達(dá)的核受體不僅僅有fxr,為確定mrp2的降低與fxr有直接關(guān)系,我們進一步檢測了fxr的另一個下游基因cyp7a1,發(fā)現(xiàn)它隨著fxr的下降而升高,由此我們確定mrp2的降低確系與fxr的降低有關(guān)。1.3在篩選il-18刺激hepg2細(xì)胞后差異性表達(dá)的核因子、轉(zhuǎn)錄因子過程中還發(fā)yy1表達(dá)明顯增高,且與il-18呈劑量依賴關(guān)系。進一步以yy1(shorthairpinrna,shrna)轉(zhuǎn)染hepg2細(xì)胞,抑制yy1表達(dá),再以il-18刺激hepg2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)原本接受il-18刺激后下調(diào)的fxr和mrp2表達(dá)均有明顯回升,提示轉(zhuǎn)錄因子yy1參與了il-18下調(diào)fxr及mrp2的過程。這與文獻報道的yy1可直接結(jié)合于fxr轉(zhuǎn)錄子啟動區(qū)并抑制fxr的轉(zhuǎn)錄相符。1.4以il-18刺激hepg2細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)核蛋白水平的p65升高、磷酸化p65蛋白升高,提示nf-κb通路的激活。進一步以p65shrna干擾nf-κb通路后發(fā)現(xiàn),原本接受il-18刺激后升高的yy1表達(dá)出現(xiàn)回落,提示yy1的表達(dá)升高是通過nf-κb通路的激活來調(diào)控的。細(xì)胞水平的研究結(jié)果提示,il-18可通過nf-κb信號通路的激活而上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子yy1的表達(dá);而因為yyi具有抑制fxr轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用,因此隨著yy1表達(dá)水平的升高,fxr的表達(dá)水平出現(xiàn)降低,并直接導(dǎo)致了受其調(diào)控的mrp2表達(dá)的降低。為了驗證這些結(jié)果,我們進一步進行了動物實驗。2.在膽道結(jié)扎的spraguedawley(sd)大鼠肝組織中觀察到mrp2、nf-κb、fxr、yy1、il-18等的變化趨勢符合體外細(xì)胞實驗的結(jié)果。我們將10只sd大鼠隨機分為2組,即膽道結(jié)扎組和假手術(shù)組,每組5只。bdl組大鼠接受膽總管結(jié)扎手術(shù),假手術(shù)組大鼠在膽總管下方鋪設(shè)手術(shù)線,但不結(jié)扎膽管。術(shù)后7天收集肝臟標(biāo)本提取總rna和蛋白,以實時定量pcr和westernblot的方法檢測大鼠肝組織il-18、mrp2、nf-κb、fxr、yy1的表達(dá)量變化。2.1相對于假手術(shù)組,bdl組大鼠肝組織中il-18mrna水平顯著升高,證實了膽汁淤積時肝組織內(nèi)il-18的表達(dá)是明顯升高的,首先驗證本研究的基礎(chǔ)問題,并與其它有關(guān)膽汁淤積時il-18血清水平升高的報道相符。2.2相對于假手術(shù)組,bdl大鼠肝組織中nf-κbp65的mrna水平明顯增加,細(xì)胞核中的p65蛋白表達(dá)量明顯增多,p65的磷酸化水平也明顯升高,驗證了膽汁淤積時肝組織內(nèi)nf-κb通路激活水平是增高的。2.3相對于假手術(shù)組,bdl大鼠肝組織中yy1的mrna及蛋白水平明顯升高,而fxr和mrp2的mrna及蛋白水平則明顯降低,符合體外細(xì)胞實驗的結(jié)果;2.4在大鼠肝組織中以染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)的方法檢測fxr與mrp2基因啟動子區(qū)的結(jié)合情況,發(fā)現(xiàn)在bdl大鼠肝組織中與mrp2啟動子區(qū)結(jié)合的fxr顯著降低,進一步證實了膽汁淤積時fxr表達(dá)的減少與mrp2的表達(dá)降低直接相關(guān)。討論多耐藥相關(guān)蛋白2(mrp2)是膽汁酸代謝平衡中的關(guān)鍵分子。生理狀態(tài)下mrp2分子呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),以維持膽汁酸的正常排泄,但是在膽汁淤積時其表達(dá)量卻明顯降低,機制尚不清楚。許多研究已證實,在發(fā)生膽汁淤積時,許多細(xì)胞因子都表現(xiàn)出對膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白的重要調(diào)節(jié)作用。il-18在膽汁淤積時也會出升高,但其是否也參與了膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)控尚未可知。近期有研究顯示,在小鼠壞死性腸炎模型中發(fā)現(xiàn),il-18與肝臟mrp2之間存在負(fù)相關(guān)性。我們假設(shè)膽汁淤積時,il-18的升高可能不僅僅炎癥反應(yīng)(機體的一種防御性反應(yīng))的一部分,它也可能對膽汁淤積的發(fā)生發(fā)展有影響,而這種影響極有可能是通過調(diào)節(jié)mrp2的表達(dá)來實現(xiàn)的。我們先在hepg2細(xì)胞水平上進行了研究。首先我們證實了il-18對mrp2確有調(diào)節(jié)作用。以il-18刺激hepg2細(xì)胞后,mrp2的mrna表達(dá)和蛋白水平表達(dá)均出現(xiàn)不同程度降低,且分析發(fā)現(xiàn)其降低與il-18之間呈現(xiàn)劑量與時間依賴效應(yīng)。隨后我們研究了il-18是通過何種機制實現(xiàn)了下調(diào)mrp2這一作用。鑒于已知的核受體對mrp2的調(diào)節(jié)均為正向,我們推測il-18抑制mrp2表達(dá)可能是通過抑制了某個核受體的表達(dá)而間接實現(xiàn)的。于是我們檢測了這些核受體在il-18刺激后的蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)fxr表達(dá)從轉(zhuǎn)錄水平到蛋白水平均出現(xiàn)了顯著的下調(diào)。在膽汁酸代謝中,fxr是促進mrp2轉(zhuǎn)錄表達(dá)的重要核受體。fxr的降低極有可能導(dǎo)致了mrp2表達(dá)的降低。我們還發(fā)現(xiàn),fxr表達(dá)的下調(diào)與il-18之間也存在劑量依賴關(guān)系,與mrp2表達(dá)下調(diào)趨勢一致。而為了更進一步證明mrp2的下調(diào)確與fxr相關(guān),我們還檢測了fxr調(diào)控下游的另外一個基因cyp7a1的表達(dá)。fxr具有間接抑制cyp7a1表達(dá)的作用。我們的檢測發(fā)現(xiàn)il-18抑制fxr表達(dá)的同時,cyp7a1的表達(dá)出現(xiàn)明顯升高,其另一個下游基因mrp2表達(dá)明顯降低,fxr兩個下游基因均出現(xiàn)符合fxr變化趨勢的變化規(guī)律,更進一步證實il-18誘導(dǎo)的mrp2表達(dá)下調(diào)可能直接由fxr的下調(diào)所導(dǎo)致。但是fxr的抑制又似乎不是il-18刺激的直接結(jié)果。近期一項研究發(fā)現(xiàn)yy1可以結(jié)合到fxr基因內(nèi)含子的一個特殊反應(yīng)原件上,從而抑制fxr基因的轉(zhuǎn)錄。于是我們推測是否膽汁淤積時fxr表達(dá)的降低也與yy1有關(guān)。我們檢測了il-18刺激后hepg2細(xì)胞中yy1的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)yy1的mrna和蛋白表達(dá)水平均呈明顯升高趨勢,且與il-18存在劑量依賴關(guān)系。為進一步驗證yy1表達(dá)升高是否導(dǎo)致了fxr表達(dá)的降低,我們對hepg2細(xì)胞進行了yy1shrna干擾。我們發(fā)現(xiàn)yy1干擾后的hepg2細(xì)胞,再接受il-18刺激后,其fxr和mrp2的表達(dá)水平僅僅出現(xiàn)輕度的下降,其下降的幅度明顯小于普通hepg2細(xì)胞接受il-18刺激后的fxr及mrp2表達(dá)下降的幅度。也就是說,yy1基因干擾削弱或部分阻斷了il-18抑制fxr和mrp2表達(dá)的效應(yīng)。換言之,yy1參與了il-18抑制fxr和mrp2表達(dá)的調(diào)控機制。最后我們還進一步闡明了il-18促進yy1表達(dá)的機制。我們通過檢測nf-κbp65亞基在細(xì)胞核內(nèi)的含量及其磷酸化水平,證實il-18可激活hepg2細(xì)胞的nf-κb信號通路。進一步以p65shrna阻斷了nf-κb信號通路后發(fā)現(xiàn),il-18誘導(dǎo)的yy1表達(dá)升高也隨著nf-κb的抑制而被抑制,同時原本接受il-18刺激后被抑制的fxr和mrp2表達(dá)水平卻出現(xiàn)回升。簡言之,il-18刺激的yy1表達(dá)是通過nf-κb信號通路傳導(dǎo)的。在細(xì)胞實驗完成后,我們勾勒出了il-18抑制mrp2表達(dá)的大致信號通路,即il-18通過nf-κb信號通路激活yy1的表達(dá),上調(diào)的yy1抑制了fxr的轉(zhuǎn)錄,從而間接的導(dǎo)致了mrp2的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。為了進一步證實以上結(jié)論,我們還建立了膽道結(jié)扎(bileduct-ligated,bdl)的大鼠模型,從大鼠肝臟組織中驗證膽汁淤積時上述因子的變化趨勢是否與細(xì)胞水平中觀察到的各因子變化趨勢一致。首先我們檢測了假手術(shù)組和bdl組大鼠肝組織中il-18mrna的表達(dá)水平,結(jié)果提示bdl大鼠肝組織中il-18mrna水平是明顯增高的,證實了整個研究的基礎(chǔ)。這也與文獻報道膽汁淤積時血清il-18水平升高相一致。然后我們發(fā)現(xiàn)bdl大鼠肝組織中p65的基因轉(zhuǎn)錄水平是增高的,肝組織核蛋白水平的p65含量是增多了,而磷酸化p65的表達(dá)量也增多,證實了膽汁淤積時nf-κb通路是激活的。其次,我們檢測到bdl大鼠肝組織中yy1的表達(dá)上調(diào),而fxr與mrp2的表達(dá)明顯下調(diào),均與細(xì)胞水平中il-18刺激后以上各因子的表達(dá)變化趨勢一致。相關(guān)性分析則進一步顯示了各因子之間均存在良好的相關(guān)性。我們知道除fxr外,mrp2還受到其它核受體的調(diào)控。為了進一步證實膽汁淤積時mrp2的下調(diào)與fxr的關(guān)系,我們在大鼠肝組織中進行了染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)實驗。chip結(jié)果顯示,bdl大鼠肝組織中與mrp2啟動子區(qū)域相結(jié)合的fxr數(shù)量明顯少于假手術(shù)組,證實了膽汁淤積中由于fxr自身轉(zhuǎn)錄水平的下降,使得其與mrp2啟動子區(qū)的結(jié)合也是降低的,從而削弱了其促進mrp2轉(zhuǎn)錄的調(diào)控能力,導(dǎo)致mrp2表達(dá)的下降。動物實驗進一步驗證了細(xì)胞實驗中各因子的變化情況,證實了膽汁淤積時肝組織內(nèi)il-18水平的上調(diào)和nf-κb信號通路的激活,證實了yy1表達(dá)的上調(diào)和fxr、mrp2表達(dá)的下調(diào),并證實了fxr的下調(diào)是導(dǎo)致mrp2下調(diào)的主要原因之一。結(jié)論本研究在hepg2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)il-18通過抑制fxr的表達(dá)而誘導(dǎo)mrp2的表達(dá)降低;同時發(fā)現(xiàn)il-18通過激活的nf-κb通路上調(diào)了轉(zhuǎn)錄因子yy1的表達(dá),而上調(diào)的yy1與fxr抑制明顯相關(guān)。在進一步的動物實驗中證實了膽汁淤積時il-18的升高、nf-κb通路的激活、yy1表達(dá)的增高以及fxr和mrp2表達(dá)的降低,并且證實fxr表達(dá)的降低直接導(dǎo)致了mrp2的表達(dá)下降。綜上所述,本研究揭示了膽汁淤積時mrp2下調(diào)的一種可能機制,即增高的il-18水平通過激活nf-κb通路而上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子yy1的表達(dá),上調(diào)的yy1抑制了fxr的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而導(dǎo)致了mrp2的表達(dá)下調(diào)。該調(diào)控機制的發(fā)現(xiàn),對于闡明膽汁淤積發(fā)生、進展機制有重要的理論意義,并可能為臨床尋找膽汁淤積治療策略提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575

【參考文獻】

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本文編號：1296019