本文關(guān)鍵詞：PTEN過(guò)表達(dá)及突變對(duì)活化肝星狀細(xì)胞骨架蛋白actin及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

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【摘要】：目的探討過(guò)表達(dá)野生型第10號(hào)染色體缺乏的磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)和其突變體G129E(僅保有蛋白磷酸酶活性而失去脂質(zhì)磷酸酶活性)對(duì)體外培養(yǎng)的活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)骨架蛋白actin及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。方法研究需要的腺病毒(AD-PTEN,AD-G129E,AD-GFP)應(yīng)用AD293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,并測(cè)量滴度;體外培養(yǎng)活化的大鼠HSC(HSC-T6細(xì)胞系),借助腺病毒將具有雙重特異性磷酸酶活性的過(guò)表達(dá)的野生型PTEN基因和其突變后僅具有蛋白磷酸酶活性的G129E基因轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞;使用Western blot和Real-time PCR檢驗(yàn)肝星狀細(xì)胞的PTEN蛋白和m RNA的表達(dá);借助激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope,LSCM),采用鈣熒光探針Rhod-2/AM負(fù)載檢測(cè)肝星狀細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、熒光素四甲基異硫氰酸羅丹明(Tetramethylrhodamine isothiocyanate,TRITC)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽檢測(cè)HSC的形態(tài)、F-actin的分布及熒光強(qiáng)度、偽足以及應(yīng)力纖維的變化。全部研究?jī)?nèi)容都使用Excel 2003建立資料庫(kù),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間比較采用LSD檢驗(yàn),P0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究分4組:1 Control:用只含有8%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染步驟用DMEM代替病毒液;2 AD-GFP組:轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的對(duì)照空病毒AD-GFP;3 AD-PTEN組:將含有過(guò)表達(dá)的PTEN基因并能合成GFP的重組腺病毒AD-PTEN轉(zhuǎn)染HSC;4 AD-G129E組:將含有G129E基因并能合成GFP的重組腺病毒AD-G129E轉(zhuǎn)染HSC。結(jié)果1通過(guò)腺病毒反復(fù)感染人胚腎細(xì)胞(AD293)的方法擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所需的腺病毒,Ad-PTEN滴度為1.3×109pfu/m L、Ad-G129E滴度為1.4×109pfu/m L及Ad-GFP滴度為1.6×109pfu/m L。2 M.O.I.值100時(shí),腺病毒轉(zhuǎn)染HSC后48h,計(jì)數(shù)GFP熒光陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,測(cè)得AD-GFP、AD-PTEN及AD-G129E各組腺病毒轉(zhuǎn)染率均80%。3腺病毒轉(zhuǎn)染后48h,應(yīng)用Western blot方法檢驗(yàn)每組HSC的PTEN蛋白顯示:AD-PTEN組(1.08±0.07)、AD-G129E組(0.97±0.04)明顯高于Control(0.56±0.05)及AD-GFP(0.69±0.07),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而Control與AD-GFP組和AD-PTEN組與AD-G129E組之間都沒(méi)有明顯差別(P0.05)。使用Real-time PCR方法檢驗(yàn)m RNA表達(dá)顯示:AD-PTEN組(6.11.±0.072)、AD-G129E組(6.167±0.047)明顯高于Control(7.043±0.036)及AD-GFP(6.990±0.037),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而Control與ADGFP組和AD-PTEN組與AD-G129E組之間都沒(méi)有明顯差別(P0.05)。4TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽檢測(cè)顯示:Control組與AD-GFP組HSC多呈星形或多邊體形,F-actin重構(gòu)形成大量粗大的應(yīng)力纖維,橫跨于整個(gè)細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞周圍可見(jiàn)層狀偽足;AD-PTEN組及AD-G129E組HSC多為梭形,F-actin主要分布于細(xì)胞周邊,細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量纖細(xì)的應(yīng)力纖維,細(xì)胞周邊層狀偽足消失;F-actin的熒光強(qiáng)度AD-PTEN組(357.67±13.39)、AD-G129E組(377.25±14.55)明顯低于Control組(961.87±27.33)及AD-GFP組(954.68±20.71),P0.05,而ADPTEN組與AD-G129E組以及Control組與AD-GFP組之間沒(méi)有明顯差別,P0.05。5鈣熒光探針Rhod-2/AM檢測(cè)HSC內(nèi)鈣離子濃度顯示:AD-PTEN組(251.60±90.88)及AD-G129E組(352.18±146.01)明顯低于Control組(1953.95±132.99)及Ad-GFP組(1937.57±115.17),P0.05,而AD-PTEN組與AD-G129E組以及Control組與AD-GFP組之間沒(méi)有明顯差別,P0.05。結(jié)論1野生型PTEN過(guò)表達(dá)可明顯抑制體外活化肝星狀細(xì)胞骨架蛋白actin的形成及細(xì)胞骨架的重構(gòu)。2野生型PTEN過(guò)表達(dá)可顯著降低肝星狀細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。3 PTEN喪失脂質(zhì)磷酸酶活性的突變對(duì)活化肝星狀細(xì)胞骨架蛋白actin及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無(wú)影響。4 PTEN通過(guò)其蛋白磷酸酶活性發(fā)揮其抑制活化肝星狀細(xì)胞骨架蛋白actin的形成及降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的作用。
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575.2

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