本文關(guān)鍵詞：Toll樣受體通路在慢加急肝衰竭患者發(fā)病及Th17細(xì)胞活化中的作用研究

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【摘要】：免疫介導(dǎo)炎癥損傷是HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭的重要特征。Th17細(xì)胞分泌的白介素(IL)17參與肝損傷,其活化被認(rèn)為在HBV相關(guān)的慢加急肝衰竭的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用,但目前對(duì)于慢加急肝衰竭中Th17細(xì)胞活化的促發(fā)原因仍不十分清楚。對(duì)自身免疫性疾病的研究顯示,Toll樣受體通路參與促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化形成及疾病的發(fā)生發(fā)展。目前,對(duì)于Toll樣受體通路在HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭發(fā)病中的作用及其對(duì)Thl7細(xì)胞分化影響的研究仍為空白。本研究以HBV相關(guān)的慢加急肝衰竭患者為研究對(duì)象,系統(tǒng)分析了T細(xì)胞上Toll樣受體的表達(dá)狀況,比較Toll樣受體與肝損傷指標(biāo)的相關(guān)性,并探討了Toll樣受體2表達(dá)對(duì)慢加急肝衰竭患者體內(nèi)Th17細(xì)胞活化及其功能的影響。本研究對(duì)闡明HBV相關(guān)的慢加急肝衰竭發(fā)病機(jī)制及尋找新的免疫治療方案提供重要的線索和理論依據(jù)。 目的 1.本研究通過對(duì)Toll樣受體家族中(TLR1-10)在健康對(duì)照、HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭和慢性乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞上表達(dá)狀況和T細(xì)胞上TLR2/4表達(dá),全面分析不同研究對(duì)象Toll樣受體的表達(dá)差異,且比較Toll樣受體的表達(dá)與肝損傷參數(shù)和HBV病毒學(xué)參數(shù)的相關(guān)性。 2.體外用Toll樣受體2配體(Pam3Csk4)刺激HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭及慢性乙肝患者外周血T細(xì)胞,檢測(cè)刺激前后Th17細(xì)胞及分泌細(xì)胞因子表達(dá)狀況變化,判斷刺激后,TH17細(xì)胞表達(dá)與臨床生化指標(biāo)之間的相關(guān)性。 3.縱向觀察體外用Toll樣受體2配體(Pam3Csk4)刺激HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭外周血T細(xì)胞,檢測(cè)Th17細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子表達(dá)變化,分析TLR2及IL-17的表達(dá)變化及疾病發(fā)展之間的相關(guān)性,從而探討TLR2在Th17應(yīng)答及致病之間的作用,為闡明Th17在HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭中致病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。 方法 1.本實(shí)驗(yàn)選取協(xié)和感染性疾病科門診或住院診療的44例HBV感染者為研究對(duì)象,其中22例為HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭(ACLF)患者,22例為慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者。另選取20例健康對(duì)照者。本研究獲得武漢協(xié)和醫(yī)院倫理學(xué)會(huì)批準(zhǔn)及所有研究對(duì)象均簽訂知情同意書,并排除其它病毒合并感染。 2.受試對(duì)象肱靜脈血用肝素鈉抗凝管采取,用Ficoll密度梯度離心法,獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞,分離后的細(xì)胞用TRIZOL法提取RNA,用于擴(kuò)增TLR1-TLR1O基因表達(dá)。 3.分離后的部分PBMC在96孔-U-型板上,培養(yǎng)4小時(shí),分別根據(jù)需要加入佛波酯(phorbol-12-myristate13-acetate, PMA),離子霉素(Ionomycin),或佛波酯,離子霉素及TLR2配體(Pam3Csk4, P3C),同時(shí)設(shè)加入培養(yǎng)基的孔為陰性對(duì)照。培養(yǎng)后細(xì)胞通過流式染色技術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞表面的TLR2表達(dá),經(jīng)穿孔破膜后染色檢測(cè)1L-21, IL-22, IL-17, IFN-γ及TNF-a的表達(dá)。 4.分離后的部分PBMC在96孔-U-型板上,通過流式染色技術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞表面TLR2/TLR4表達(dá)。 5.通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒標(biāo)志物：乙肝三系；丙肝抗體；艾滋病抗體等 6.臨床生化指標(biāo)來源于協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科。 7.用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所用的方法為曼惠特尼U檢驗(yàn)(Mann-Whitney U test),威氏配對(duì)符號(hào)秩檢驗(yàn)(Wilcoxon matched pairs test)斯皮爾曼秩相關(guān)性檢驗(yàn)(Spearman rank correlation)等,p值0.05認(rèn)為有顯著差異性。 結(jié)果 1.通過RT-PCR方法檢測(cè)慢加急肝衰竭患者、慢性乙肝患者及健康者TLR1-10mRNA的總體表達(dá)譜,結(jié)果顯示,與健康對(duì)照相比,ACLF患者TLR1/2/4/5/6/10mRNA表達(dá)明顯增高,CHB患者TLR1/2/3//4/5/6/8/9/10mRNA表達(dá)明顯增高,且TLR2/4表達(dá)明顯高于其他TLRs;與慢性乙肝患者相比,ACLF患者TLR2/6mRNA表達(dá)明顯增高,而TLR8/9mRNA表達(dá)低于CHB患者。 2.將上述HBV感染患者,按照HBeAg+及HBeAg患者分類,比較TLR1-10mRNA總體表達(dá)譜,結(jié)果顯示：與健康對(duì)照相比,HBeAg+/HBeAg患者TLR2/4/5/6/8/9/10mRNA表達(dá)明顯升高,且以TLR2/4表達(dá)最高。雖然HBeAg+患(?)TLR2/4/5/6/8/9/10mRNA表達(dá)明顯低于HBeAg-患者,但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢加急肝衰竭患者、CHB患者及健康者外周血PBMC中CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞上TLR2/4的表達(dá),結(jié)果示：CD4+T細(xì)胞上TLR2/4表達(dá)在ACLF組明顯高于CHB組和健康對(duì)照組：CHB組CD4+T細(xì)胞上TLR2表達(dá)高于健康對(duì)照組。CD8+T細(xì)胞上TLR2/4表達(dá)在ACLF組明顯高于CHB組和健康對(duì)照組；CHB組CD8+T細(xì)胞上TLR2表達(dá)高于健康對(duì)照組。 4. TLR1-10mRNA表達(dá)水平與臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性分析,結(jié)果顯示：在慢性乙肝患者中,TLR3mRNA表達(dá)與HBV DNA表達(dá)呈正相關(guān),TLR7mRNA表達(dá)與血清ALT水平呈正相關(guān)。 5.HBV感染患者中,CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞上TLR2/4表達(dá)與臨床指標(biāo)總膽紅素(total bilirubin, TBIL),直接膽紅素(direct bilirubin, DBIL),堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP),國際標(biāo)準(zhǔn)化值(International Normalized Ratio, INR)呈正相關(guān),與白蛋白(Albumin, ALB)呈負(fù)相關(guān)。此外,CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞上TLR2表達(dá)與谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST),凝血酶原時(shí)間(prothrombin time, PT),白細(xì)胞(white blood cell, WBC)呈正相關(guān),總蛋白(Total Protein, TP),血小板(platelet, PLT)呈負(fù)相關(guān)。CD4+T細(xì)胞上TLR4表達(dá)與凝血酶原時(shí)間(PT)、白細(xì)胞(WBC)呈正相關(guān)。 6.慢加急肝衰竭患者PBMC中IL-17mRNA的表達(dá)明顯高于慢性乙肝患者及健康對(duì)照。 7.慢加急肝衰竭患者PBMC中IL-17mRNA表達(dá)與總膽紅素及直接膽紅素呈正相關(guān)。 8.慢加急肝衰竭患者外周血Th17細(xì)胞的頻率增加,明顯高于慢性乙肝患者及健康對(duì)照組。 9.慢加急肝衰竭患者、慢乙肝患者和健康對(duì)照者PBMC在體外用TLR2配體刺激后： 1)慢加急肝衰竭和慢乙肝患者CD4+T細(xì)胞上IL17表達(dá)明顯增加,但是健康對(duì)照組刺激前后IL-17表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2)Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(IL-22, IL-21)及促炎因子(IFN-γ, TNF-a)明顯增加,但是在健康對(duì)照組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3)慢加急肝衰竭患者上述細(xì)胞因子的表達(dá)高于慢性乙肝患者和健康對(duì)照組,但是IFN-γ的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4)慢加急肝衰竭患者Thl7細(xì)胞的表達(dá)頻率與總膽紅素,直接膽紅素呈正相關(guān),與白蛋白呈負(fù)相關(guān)。5)慢加急肝衰竭患者TH17細(xì)胞表達(dá)頻率與TLR2表達(dá)呈正相關(guān)。 10.縱向觀察慢加急肝衰竭患者伴隨病情的發(fā)展,其CD4+T細(xì)胞上IL-17及TLR2的表達(dá)狀況,顯示：隨著病情的加重,IL-17A的表達(dá)與TLR2的表達(dá)增加。但是伴隨著病情的好轉(zhuǎn),IL-17/TLR2表達(dá)明顯降低。 結(jié)論 1.慢加急肝衰竭患者外周血TLR2/4mRNA表達(dá)及TLR2/4蛋白表達(dá)水平明顯高于慢性乙肝患者和健康對(duì)照組。提示慢加急肝衰竭患者體內(nèi)存在天然免疫的活化及感染的存在。 2.慢加急肝衰竭患者外周血Th17頻率及分泌的細(xì)胞因子明顯高于慢性乙肝患者及健康對(duì)照組,提示Thl7參與慢加急肝衰竭患者的肝損傷。 3.慢加急肝衰竭患者Th17細(xì)胞的表達(dá)頻率及分泌的細(xì)胞因子,在TLR2配體刺激下明顯增加。Thl7表達(dá)與臨床病情重癥指標(biāo)相關(guān),且TH17細(xì)胞表達(dá)頻率與TLR2表達(dá)呈正相關(guān),提示慢加急肝衰竭患者體內(nèi)Th17細(xì)胞的活化的機(jī)制可能是TLR2參與啟動(dòng)Th17細(xì)胞的反應(yīng),加重對(duì)慢加急肝衰竭患者的肝損傷。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn) 4.本研究立足于文獻(xiàn)報(bào)道的研究成果,充分依據(jù)現(xiàn)有的理論基礎(chǔ),創(chuàng)新性提出將天然免疫(Toll樣受體(TLR2))與獲得性免疫(Th17細(xì)胞)為研究對(duì)象,研究它們?cè)诼蛹备嗡ソ呋颊咧斜磉_(dá)狀況,及與臨床疾病進(jìn)展之間的關(guān)系,探討TLR2可能參與Th17細(xì)胞在慢加急肝衰竭患者中的致病作用,而有關(guān)這方面的研究目前尚無相關(guān)的研究報(bào)道。 5.通過TLR2配體刺激慢加急肝衰竭患者的PBMC,檢測(cè)Th17細(xì)胞的表達(dá)頻率及分泌的細(xì)胞因子表達(dá)增加,及其與臨床檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性,為探討慢加急肝衰竭患者Thl7致病機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ),為慢加急肝衰竭患者的臨床檢測(cè)及治療提供新的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575.3

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6 黃樂;田德英;;肝衰竭患者醫(yī)院內(nèi)感染的臨床特征及預(yù)后分析[J];中國醫(yī)療前沿;2013年05期

7 許鎮(zhèn)額;林曼芝;蔣曉織;;血漿濾過透析治療肝衰竭患者焦慮狀況調(diào)查與分析[J];福建醫(yī)藥雜志;2013年01期

8 張野;聶青和;;1892例肝衰竭患者并發(fā)癥及死亡原因分析[J];實(shí)用肝臟病雜志;2014年02期

9 劉新礦;;全身性炎癥反應(yīng)綜合征對(duì)肝衰竭患者預(yù)后的影響[J];實(shí)用肝臟病雜志;2008年04期

10 鄭春曉;甘艷心;黃斯英;;肝衰竭患者的營養(yǎng)支持[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2008年14期

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1 劉歡;韓濤;于美麗;;肝衰竭患者血漿總同型半胱氨酸水平的檢測(cè)[A];第一屆全國疑難重型肝病大會(huì)、第四屆全國人工肝及血液凈化學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2008年

2 茹清靜;葉衛(wèi)江;楊丹紅;鄭臨;崔景;章亮;施維群;徐珊;;肝衰竭患者胃氣的定量評(píng)估及其與預(yù)后的關(guān)系[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)第二十三次全國脾胃病學(xué)術(shù)交流會(huì)論文匯編[C];2011年

3 茹清靜;葉衛(wèi)江;楊丹紅;鄭臨;崔景;章亮;施維群;徐珊;;肝衰竭患者胃氣定量評(píng)估及其與預(yù)后的關(guān)系[A];浙江省中醫(yī)藥學(xué)會(huì)第二屆“之江中醫(yī)藥論壇”暨2012年學(xué)術(shù)年會(huì)文集[C];2012年

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6 胡愛榮;蔣素文;葉俊茂;朱海超;宣王益;胡耀仁;王雪麗;陳紅;徐敏芬;;脈沖式色素濃度分析法吲哚菁綠清除試驗(yàn)在肝衰竭患者中的應(yīng)用及預(yù)測(cè)價(jià)值[A];第6屆全國疑難及重癥肝病大會(huì)論文集[C];2011年

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10 曹麗霞;趙桂鳴;曹武奎;;102例肝衰竭患者內(nèi)毒素水平臨床意義分析[A];第二屆全國病毒性肝炎慢性化重癥化基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

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1 王澤議;人工肝支持系統(tǒng)為肝衰竭患者帶來新希望[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

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1 徐春利;Toll樣受體通路在慢加急肝衰竭患者發(fā)病及Th17細(xì)胞活化中的作用研究[D];華中科技大學(xué);2015年

2 吳貽琛;慢加急性(亞急性)肝衰竭患者外周血造血干細(xì)胞生物學(xué)活性及其臨床應(yīng)用前期研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

3 俞海英;人肝再生增強(qiáng)子的克隆、表達(dá)及其在肝衰竭患者中表達(dá)水平的研究[D];浙江大學(xué);2014年

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1 陳屹一;肝衰竭患者外周血維生素D結(jié)合蛋白水平與療效及預(yù)后的相關(guān)性研究[D];浙江大學(xué);2008年

2 張璽;影響肝衰竭患者血乳酸水平的相關(guān)因素分析[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

3 高艷穎;影響肝衰竭患者預(yù)后和生存時(shí)間的臨床研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

4 劉瑩;肝衰竭患者血清胸腺素β4的檢測(cè)及臨床意義[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

5 張睿;甲胎蛋白聯(lián)合終末期肝病模型評(píng)分對(duì)肝衰竭患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值[D];吉林大學(xué);2014年

6 周健;人工肝治療對(duì)肝衰竭患者肝臟儲(chǔ)備功能影響的研究[D];浙江大學(xué);2011年

7 張強(qiáng);79例亞急性肝衰竭患者臨床特征分析及中西醫(yī)結(jié)合治療療效評(píng)價(jià)[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

8 劉歡;肝衰竭患者血清多肽指紋圖譜的檢測(cè)及其臨床意義[D];天津醫(yī)科大學(xué);2009年

9 李瑋;肝衰竭患者血漿抑制HepG2細(xì)胞生長和增殖的研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2010年

10 孫李建;血栓彈力圖在肝病患者中的應(yīng)用研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2013年

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