本文關(guān)鍵詞：京尼平苷酸基于FXR抗ANIT誘導(dǎo)膽汁淤積大鼠保肝利膽機(jī)制研究

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【摘要】：目的：膽汁淤積(Cholestasis),是指肝細(xì)胞或者膽管水平的膽汁生成和排泄功能障礙、致使膽汁到達(dá)十二指腸的量減少,膽汁成分反流入血,稱(chēng)為膽汁淤積或淤膽,若血中膽汁酸和膽紅素均增高則稱(chēng)為膽汁淤積性黃疸。南方地區(qū)氣候?yàn)槌睗駩灍岫嘤?濕熱病癥中的膽汁淤積十分常見(jiàn)且發(fā)病率極高。膽汁淤積癥是現(xiàn)代臨床常見(jiàn)病種,其發(fā)病的機(jī)制極其復(fù)雜,臨床治療也缺乏行之有效的藥物。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中,清熱利濕中藥在抗膽汁淤積方面有其獨(dú)特的療效和優(yōu)勢(shì),尤其以富含環(huán)烯醚萜類(lèi)中藥見(jiàn)長(zhǎng),但其作用機(jī)制尚無(wú)明確定論,本文考察環(huán)烯醚萜化合物京尼平苷酸在保肝利膽作用的有效性和機(jī)制探究,為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。方法：1.京尼平苷酸(GPA)純度測(cè)定及其小鼠體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)建立HPLC法分析測(cè)定京尼平苷酸純度以及在昆明種小鼠體內(nèi)進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)并確定GPA的半數(shù)致死量(LD50)。死亡小鼠及時(shí)尸檢,觀察其主要器官組織有無(wú)異常,其余小鼠在觀察期結(jié)束后處死解剖,觀察其主要器官有無(wú)異常。給藥前及給藥后1周稱(chēng)量小鼠體重,并進(jìn)行比較。2.GPA對(duì)α-萘異硫氰酸酯(ANIT)誘導(dǎo)大鼠肝內(nèi)膽汁淤積保肝利膽藥效及機(jī)制研究第一組：空白對(duì)照組(1:Blank control):市售大豆油灌1mL/100gB.W./d連續(xù)灌胃7天(d);第二組：模型對(duì)照組(2:ANIT treated model):第5天一次性灌胃ANIT 65 mg/kg,其余每天灌胃同空白對(duì)照組灌大豆油1mL/100g B.W./d;第三組：陽(yáng)性對(duì)照組(3:ANIT+100 mg/kg B.W.UDA):灌胃熊去氧膽酸100 mg/kg/d,連續(xù)灌胃7天,在第5天一次性灌胃ANIT 65 mg/kg;第四組：京尼平苷酸高劑量組(4:ANIT+100 mg/kg B.W. GPA):灌胃京尼平苷酸100 mg/kg,連續(xù)灌胃7天,在第5天一次性灌胃ANIT 65 mg/kg;第五組：京尼平苷酸中劑量組(5:ANIT+50 mg/kg B.W. GPA):灌胃京尼平苷酸50 mg/kg,連續(xù)灌胃7天,在第5天一次性灌胃ANIT 65 mg/kg;第六組：京尼平苷酸低劑量組(6:ANIT+25 mg/kg B.W. GPA):灌胃京尼平苷酸25 mg/kg,連續(xù)灌胃7天,在第5天一次性灌胃ANIT 65 mg/kg;連續(xù)灌胃給藥7天,其中第5天除空白對(duì)照組外其它組灌胃給予ANIT(65 mg/kg)一次。第7天末次給藥1h后,腹腔注射20%的烏拉坦麻醉,固定,進(jìn)行膽總管插管手術(shù),分段收集膽汁,腹主動(dòng)脈取血,摘取肝臟,膽汁和肝重稱(chēng)重,檢測(cè)膽汁葉1GSH/TB/DB /TBA以及血清GOT/GPT/γ-GT/TB/DB/TBA量或活性,H-E染色考察GPA對(duì)ANIT誘發(fā)大鼠的肝內(nèi)膽汁淤積的肝組織病理學(xué)觀察,免疫熒光雙染法,檢測(cè)肝組織中MRP2/BSEP在組織中位置表達(dá),Western Blot/RT-PCR法檢測(cè)GPA干預(yù)SNIT誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積模型大鼠的肝組織中MRP2/BSEP/FXR蛋白／基因表達(dá)。3.GPA在正常和ANIT(100mg/kgB.W.)誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)比較分析GPA一次灌胃給24只正常大鼠和24只ANIT膽汁淤積模型大鼠,各分為3組(高、中、低,GPA劑量為100,50,25mg/kg),每組8只。建立HPLC-UV法測(cè)定各組大鼠分別于給藥前,及藥后5,15,30 min,以及1,2,3,4,6,8,12,24 h時(shí)間點(diǎn)GPA血藥濃度,用PK_solution 2.0計(jì)算各組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。Phenomenex C18(250 mm×4.60 mm,5μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-0.5%冰醋酸(28：72)；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；檢測(cè)15 min；流速：1.0mL/min;柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。4.GPA對(duì)BRL-3A的細(xì)胞活性及增殖測(cè)定運(yùn)用CCK-8法測(cè)定BRL-3A細(xì)胞分別按2000、4000、6000個(gè)／孔的細(xì)胞數(shù)量接種的生長(zhǎng)曲線,根據(jù)細(xì)胞濃度和培養(yǎng)天數(shù),確定最佳細(xì)胞種植密度。用DMEM高糖培養(yǎng)基將GPA稀釋成濃度為500、200、100、50、20、10、5、2、1、0.10 mmol/L的含GPA培養(yǎng)基。細(xì)胞以4000個(gè)／孔的數(shù)量,重復(fù)5孔接種于96孔板,培養(yǎng)48 h,依次加入上述濃度含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,用CCK-8檢測(cè),根據(jù)細(xì)胞存活率計(jì)算GPA對(duì)BRL-3A的IC50值。5.GPA對(duì)BRL-3A大鼠肝細(xì)胞中FXR/MRP2/BSEP蛋白和基因的表達(dá)水平的影響將細(xì)胞分為正常對(duì)照組(不加處理因素,常規(guī)條件下培養(yǎng)),GPA高、中、低劑量組(加入終濃度為4、1、0.25 mmol/L的GPA誘導(dǎo)48 h,每組兩塊6孔板。48 h后,收集蛋白和RNA樣本。WB和RT-PCR法檢測(cè)GPA干預(yù)BRL-3A大鼠肝細(xì)胞中MRP2/BSEP/FXR蛋白和基因表達(dá)6.GPA對(duì)siRNAFXR介導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞FXR基因沉默后細(xì)胞中MRP2/BSEP蛋白和基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為正常組(即常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞,未進(jìn)行任何處理)、陰性對(duì)照組(及空白轉(zhuǎn)染)、siRNA-FXR組(即轉(zhuǎn)染siRNA-FXR)、siRNA-FXR+GPA 4 mM組(即轉(zhuǎn)染siRNA-FXR后用4 mM的GPA進(jìn)行干預(yù))、siRNA-FXR+GPA 1 mM組(即轉(zhuǎn)染siRNA-FXR后用1mM的GPA進(jìn)行干預(yù))、siFXR+GPA 0.25 mM組(即轉(zhuǎn)染siRNA-FXR后用0.25 mM的GPA進(jìn)行干預(yù))。轉(zhuǎn)染6 h后,更換培養(yǎng)基繼續(xù)正常培養(yǎng)至24 h,24 h后在按各組分組情況按GPA的量相應(yīng)加入。WB和RT-PCR法法檢測(cè)GPA對(duì)siRNA-FXR轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中FXR/MRP2/BSEP的蛋白和基因水平的影響。結(jié)果：1.根據(jù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)使用的GPA的純度為98.69%為純度較高的單一化合物；使用Bliss法測(cè)定GPA小鼠半數(shù)致死量為L(zhǎng)D50=2.6204 g/kg,,化合物經(jīng)口急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)小鼠一次經(jīng)灌胃LD50大于15000 mg/kg,可認(rèn)定為無(wú)毒化合物,故此實(shí)驗(yàn)表明京尼平苷酸口服給藥安全范圍大。2.用一次灌胃65 mg/kg的ANIT在給藥48 h后具有明顯的致膽汁淤積的效果；與空白對(duì)照組,ANIT誘導(dǎo)組明顯抑制膽汁流量(P0.01),同時(shí)明顯降低了膽汁中TB/DB/TBA含量(P0.01),顯著(P0.01)升高了血清中TB/DB/TBA的含量和GOT/GPT/y-GT酶活性,肝組織病理圖顯示細(xì)胞水腫,重度的炎細(xì)胞浸潤(rùn),肝血竇內(nèi)有淤膽,有大量膽汁橫溢,膽管受損；與ANIT誘導(dǎo)組比較,100 mg/kg GPA高劑量組的膽汁流量顯著提高(P0.01),膽汁中TB/DB/TBA/GSH的含量也顯著提高(P0.01),而血清中TB/DB/TBA的含量和GOT/GPT/y-GT酶活性顯著降低(P0.01),肝組織病變程度較ANIT組顯著改善�？梢�(jiàn),GPA的作用與劑量呈現(xiàn)正相關(guān)。3.免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組比較,65 mg/kg的ANIT的誘導(dǎo)能明顯抑制BSEP的表達(dá)；與ANIT模型誘導(dǎo)組比較,在使用UDA和GPA保護(hù)的干預(yù)治療的大鼠肝組織中BSEP的表達(dá)區(qū)域明顯增加,且GPA的劑量高低對(duì)BSEP表達(dá)區(qū)域的增加也呈現(xiàn)明顯的劑量正相關(guān)；然而,在免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞質(zhì)和胞漿中MRP2的表達(dá),沒(méi)有明顯的表現(xiàn)出差異。WB和RT-PCR檢測(cè)表明,與空白對(duì)照組比較,65 mg/kg的ANIT誘導(dǎo)的各組大鼠肝組織中FXR/MRP2/BSEP的蛋白和基因表達(dá)量極顯著性的降低(P0.01)；而與ANIT誘導(dǎo)組,灌服熊去氧膽酸,FXR/MRP2/BSEP的蛋白和基因表達(dá)水平有較明顯的提高(P0.01)：用GPA給予7天的預(yù)防性治療,高劑量的GPA對(duì)FXR/MRP2/BSEP蛋白何人基因表現(xiàn)出極明顯的提高(P0.01),中劑量的GPA也表現(xiàn)出明顯上調(diào)FXR/MRP2/BSEP蛋白和基因的表達(dá)水平(P0.05),GPA上調(diào)FXR/MRP2/BSEP蛋白水平的能力與其劑量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,25 mg/kg GPA的預(yù)防給藥與一次性給予65 mg/kg ANIT的模型誘導(dǎo)組比較,在蛋白水平表達(dá)上未見(jiàn)明顯區(qū)別,而基因出明顯提高的效果(P0.05)。4.正常大鼠給予高、中、低劑量的GPA對(duì)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)CL和T1/2并無(wú)明顯的影響,統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差別；用100 mg/kg ANIT造模大鼠和正常大鼠比較,ANIT造模大鼠的CL和T1/2明顯要比正常大鼠延長(zhǎng),統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(P0.05)；從Cmax的結(jié)果上看,ANIT造模大鼠的Cmax均比正常組的大鼠要高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異(P0.05)；從平均駐留時(shí)間MRT0→t上看,ANIT造模大鼠體內(nèi)的GPA的MRT0→t相對(duì)正常大鼠的均延長(zhǎng)30%,且不同劑量均有延長(zhǎng),在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異(P0.05)；從AUC0→t上看,GPA在膽汁淤積大鼠體內(nèi)的AUC0→t明顯高于正常大鼠,且高劑量提高21%、中劑量提高22%、低劑量提高26%,且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),均有顯著性差異。5. BRL-3A細(xì)胞以4000個(gè)／孔數(shù)量,生長(zhǎng)速度符合實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)時(shí)按125倍的96孔板細(xì)胞接種數(shù)量,接種于6孔板中,即5×105個(gè)／孔接種。GPA對(duì)BRL-3A細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50的測(cè)定,半數(shù)抑制率濃度,得到IC50=39.37mM,依據(jù)不大于十分之一的劑量作為給藥高劑量4 mM,1 mM為中劑量,0.25 mM為低劑量。6.WB和RT-PCR法檢測(cè)GPA干擾BRL-3A細(xì)胞中FXR/MRP2/BSEP蛋白和基因表達(dá)水平,不同劑量的GPA對(duì)BRL-3A處理48 h后,與未使用GPA干擾的BRL-3A細(xì)胞相比,4 mM劑量的GPA能夠非常顯著(P0.01)上調(diào)BRL-3A細(xì)胞中FXR/MRP2/BSEP蛋白和基因的表達(dá)水平；1mM劑量的GPA能夠非常顯著的上調(diào)(P0.01)上調(diào)BRL-3A細(xì)胞中FXR/BSEP蛋白的表達(dá)量,同時(shí)顯著(P0.05)上調(diào)MRP2的蛋白表達(dá)量,1 mM劑量的GPA能夠顯著上調(diào)(P0.05)BRL-3A細(xì)胞中FXR/BSEP基因水平,極顯著(P0.01)上調(diào)MRP2基因的水平；0.25 mM的GPA對(duì)蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,0.25mM的GPA對(duì)BRL-3A細(xì)胞中MRP2具有顯著的上調(diào)作用(P0.05)。7.WB和RT-PCR檢測(cè)表明,FXR基因沉默后,與正常培養(yǎng)的BRL-3A細(xì)胞相比；轉(zhuǎn)染siRNA-FXR的細(xì)胞,其FXR的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.01),MRP2和BSEP的基因和蛋白水平也顯著降低(P0.01)；而與空白轉(zhuǎn)染組(陰性轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)染了siRNA-Negative)組相比,轉(zhuǎn)染組的FXR、MRP2和BSEP的表達(dá)水平均降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；而陰性轉(zhuǎn)染組與正常組相比,FXR的表達(dá)水平?jīng)]有差異(P0.05)。與轉(zhuǎn)染siRNA-FXR的各組細(xì)胞相比,siRNA-FXR+4 mM GPA組、siRNA-FXR+1 mM GPA組、siRNA-FXR+0.25 mM GPA組中的FXR、MRP2和BSEP基因和蛋白水平,均有一定的提高,且呈劑量正相關(guān),其中siRNA-FXR+4 mM GPA組具有顯著性差異(P0.01)。結(jié)論：京尼平苷酸對(duì)ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積模型大鼠具有保肝利膽藥效,結(jié)合體內(nèi)外研究及沉默F(xiàn)XR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GPA的保肝利膽機(jī)制可能是其通過(guò)核受體FXR調(diào)節(jié)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2和BSEP功能改變調(diào)節(jié)膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)體功能實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R575

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本文編號(hào)：1250632