本文關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞去分化及其機(jī)制

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【摘要】：【研究背景及目的】傳統(tǒng)觀點認(rèn)為組織發(fā)育和細(xì)胞分化是一個單向性的過程,即由干細(xì)胞/前體細(xì)胞向體細(xì)胞分化。因此,在組織正常更新或損傷情況下,干細(xì)胞/前體細(xì)胞在組織再生過程中發(fā)揮重要作用。然而,到目前為止,干細(xì)胞/前體細(xì)胞的這種重要作用只在僅有的幾個器官中得到證實,其他大多數(shù)器官中則缺乏相應(yīng)的研究證據(jù)。肝臟就是其中之一。肝臟中的干細(xì)胞/前體細(xì)胞稱為肝前體細(xì)胞(Hepatic Progenitor Cells,HPCs),其可向肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞雙向分化。由于HPCs可表達(dá)多種細(xì)胞標(biāo)志物而缺乏特異性標(biāo)志物,其來源及到目前為止尚不十分清楚。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為HPCs來自膽管末端的Hering管,也有研究提示骨髓干細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞等也是HPCs來源之一。此外,也有研究顯示肝細(xì)胞可作為HPcs的另一來源。肝臟由于其特殊的位置和功能,使其成為生物體中非常特殊的器官之一。作為其主要實質(zhì)構(gòu)成及功能發(fā)生單位,肝細(xì)胞也因此擁有與其他體細(xì)胞不同的生理特性,如可無限增殖及向膽管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化等。最新的體內(nèi)外研究顯示肝細(xì)胞也可去分化為HPCs。然而,這些研究均缺乏嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖V系追蹤證據(jù)加以證實,也未對肝細(xì)胞去分化的機(jī)制做深一步的研究。肝細(xì)胞核因子4α(Hepatocyte Nuclear Factor 4α,HNF4α)是肝臟富集的一類轉(zhuǎn)錄因子,在肝臟發(fā)育和功能維持中發(fā)揮重要作用。研究顯示HNF4α還可促進(jìn)肝癌細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞分化,但其在成熟肝細(xì)胞去分化中的作用未見報道�；谝陨涎芯勘尘�,本研究利用多種轉(zhuǎn)基因小鼠及動物模型明確不同肝損傷情況下肝細(xì)胞在肝臟再生中的作用及肝細(xì)胞是否可作為肝前體細(xì)胞來源之一,并初步探討其機(jī)制�！緦嶒灧椒ā恳�、肝細(xì)胞特異性表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建甲狀腺結(jié)合球蛋白(TBG)為肝細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白。本研究采用mTomato-mGFP雙重?zé)晒鈽?biāo)記小鼠,攜帶TBG啟動子及內(nèi)含子的血清Ⅷ型腺相關(guān)病毒(AAV8-TBG)可驅(qū)動下游基因在成熟肝細(xì)胞中特異表達(dá)。小鼠尾靜脈注射攜帶Cre重組酶基因的AAV8-TBG(AAV8-TBG-Cre)后使肝細(xì)胞特異性標(biāo)記GFP而呈現(xiàn)綠色熒光,其他非肝細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。二、明確急性肝損傷時肝臟再生情況mTomato-mGFP小鼠尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre標(biāo)記肝細(xì)胞后,給予腹腔注射四氯化碳每周兩次注射兩周,或行肝大部切除術(shù),構(gòu)建急性肝損傷模型。觀察肝臟組織中紅色和綠色熒光標(biāo)記區(qū)域的細(xì)胞變化情況。免疫熒光檢測HNF4α與紅色或綠色熒光表達(dá)。三、明確慢性肝損傷時肝細(xì)胞是否可以去分化為HPCs上述老鼠繼續(xù)延長DDC飲食造模時間,免疫熒光檢測PCK、Ep CAM、Sox9等HPCs標(biāo)志物表達(dá)并追蹤其熒光標(biāo)記。在CDE飲食模型中重復(fù)觀察上述現(xiàn)象。分離小鼠原代肝細(xì)胞,收集RNA和蛋白,RT-PCR和Western blot檢測成熟肝細(xì)胞及HPCs相關(guān)基因表達(dá)。四、初步明確HNF4α表達(dá)在肝細(xì)胞去分化中的作用分離DDC飲食不同時間點小鼠原代肝細(xì)胞,收集RNA和蛋白,RT-PCR和Westernblot檢測各時間點HNF4α表達(dá)量變化。將mTomato-mGFP小鼠與HNF4aflox/flox小鼠雜交后,尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre,構(gòu)建肝細(xì)胞特異性敲除HNF4α轉(zhuǎn)基因小鼠,免疫熒光檢測肝臟組織中Sox9的表達(dá)。分離小鼠原代肝細(xì)胞,收集RNA和蛋白,RT-PCR和Western blot檢測成熟肝細(xì)胞及HPCs相關(guān)基因表達(dá)�！緦嶒灲Y(jié)果】一、成功構(gòu)建肝細(xì)胞特異性表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠mTomato-mGFP小鼠尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre后可見肝臟組織內(nèi)除匯管區(qū)及間質(zhì)部位細(xì)胞表達(dá)綠色熒光外,幾乎所有肝細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光。免疫熒光對多種細(xì)胞特異性標(biāo)志物如HNF4α、PCK、Sox9、GFAP、α-SMA、F4/80、CD34檢測,發(fā)現(xiàn)所有表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞均為肝細(xì)胞,而其他細(xì)胞包括膽管上皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等則表達(dá)紅色熒光。表明該模式動物可明確的區(qū)分出肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞,結(jié)合免疫熒光技術(shù)我們可直觀的探究肝細(xì)胞的來源和去路,是進(jìn)行譜系追蹤研究肝細(xì)胞去分化的理想動物模型。二、急性肝損傷后再生肝細(xì)胞來源于肝細(xì)胞自我復(fù)制mTomato-mGFP小鼠尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre標(biāo)記肝細(xì)胞,腹腔注射四氯化碳或行肝大部切除術(shù)構(gòu)建急性肝損傷模型,免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)門靜脈區(qū)域紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量無明顯增加,也未發(fā)現(xiàn)紅色熒光標(biāo)記的肝細(xì)胞樣細(xì)胞的出現(xiàn),HNF4α檢測也發(fā)現(xiàn)所有HNF4α陽性的細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光,未見紅色熒光標(biāo)記的HNF4α陽性的細(xì)胞出現(xiàn)。提示急性肝損傷后再生過程中殘存肝細(xì)胞自我復(fù)制是新生肝細(xì)胞的唯一來源。三、慢性肝損傷時肝細(xì)胞可發(fā)生去分化1、繼續(xù)進(jìn)行DDC飲食4-12周,每隔一周檢測各時間點肝臟再生情況。發(fā)現(xiàn)隨著DDC飲食時間的延長,散在的PCK陽性的細(xì)胞逐漸增多,至DDC飲食6周開始出現(xiàn)綠色熒光標(biāo)記的PCK陽性的細(xì)胞并逐漸增多。多種HPCs標(biāo)志物檢測也發(fā)現(xiàn)了散在的綠色熒光標(biāo)記的Sox9、Ep CAM陽性的細(xì)胞。說明DDC飲食所致慢性肝損傷達(dá)一定程度時部分肝細(xì)胞發(fā)生了去分化。2、普通C57小鼠進(jìn)行DDC飲食造模4周,每隔一周分離各時間點小鼠原代肝細(xì)胞,收集RNSA和蛋白。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)成熟肝細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)逐漸降低,HPCs相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)明顯增加。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)隨著DDC飲食延長,Sox9的表達(dá)逐漸增加。分別在RNA和蛋白水平證實了肝細(xì)胞去分化現(xiàn)象。3、mTomato-mGFP小鼠尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre標(biāo)記肝細(xì)胞,給予CDE飲食造模,觀察肝臟組織再生情況。我們同樣觀察到隨著CDE飲食的延長,門靜脈區(qū)域紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。至CDE飲食6周開始出現(xiàn)散在的綠色熒光標(biāo)記的Sox9、PCK、Ep CAM陽性的細(xì)胞。提示CDE飲食所致慢性肝損傷中肝細(xì)胞去分化現(xiàn)象仍然存在。四、肝細(xì)胞特異性敲除HNF4α后可發(fā)生自發(fā)去分化1、普通C57小鼠進(jìn)行DDC飲食造模4周,每隔一周分離各時間點小鼠原代肝細(xì)胞,收集RNA和蛋白,RT-PCR、Western blot檢測發(fā)現(xiàn),隨著DDC飲食的延長,HPCs標(biāo)志物表達(dá)量增加的同時HNF4α的表達(dá)量逐漸減少。提示肝細(xì)胞內(nèi)HNF4α可能在損傷后肝細(xì)胞去分化過程中發(fā)揮一定的作用。2、構(gòu)建肝細(xì)胞特異性敲除HNF4α小鼠,免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)在敲除HNF4α的肝細(xì)胞中,約50%的細(xì)胞表達(dá)Sox9。分離原代肝細(xì)胞,收集RNA和蛋白。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)HNF4α敲除小鼠成熟肝細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)逐漸降低,HPCs相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)明顯增加。Western blot檢測也發(fā)現(xiàn)HNF4α敲除小鼠肝細(xì)胞中Sox9的表達(dá)明顯增加。提示HNF4α在維持成熟肝細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用,其表達(dá)下降是調(diào)控肝細(xì)胞去分化的重要機(jī)制之一�！窘Y(jié)論】一、急性肝臟損傷時肝細(xì)胞通過自我復(fù)制完成肝臟再生。二、慢性肝臟損傷時肝細(xì)胞可去分化為HPCs。三、HNF4α表達(dá)下降在肝細(xì)胞去分化中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Dharmendra Kumar;Thirumala R Talluri;Taruna Anand;Wilfried A Kues;;Induced pluripotent stem cells: Mechanisms, achievements and perspectives in farm animals[J];World Journal of Stem Cells;2015年02期

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本文編號：1219256