本文關(guān)鍵詞：腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞在潰瘍性結(jié)腸炎炎癥—腫瘤序列演進中的作用研究

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【摘要】：目的通過對AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型腹腔注射腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞(EGC)培養(yǎng)上清液進行干預(yù),以及將EGC與小鼠腸上皮細胞(IEC-6)共培養(yǎng),從體內(nèi)體外兩方面探討EGC在潰瘍性結(jié)腸炎炎癥-腫瘤序列演進中的作用及可能機制。方法1采用隨機數(shù)字表法將180只SPF級雌性BALB/C小鼠隨機分為4組,即:A實驗組(EGC+DSS),B條件對照組(DMEM+DSS),C模型組(DSS)和D空白對照組(Control)。前三組給予AOM及2%DSS干預(yù),構(gòu)建結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型,定時觀察記錄各組小鼠的一般情況,并進行疾病活動指數(shù)(DAI)評分。實驗組從第4周開始每天腹腔注射EGC培養(yǎng)上清液100uL干預(yù)。各組分別在實驗第1、3、4、6、7、9、12、15及20周末采用隨機數(shù)字表法隨機抽取5只小鼠采集外周血后處死小鼠,收集腸組織標本。外周血離心后收集血清標本采用抗體芯片檢測炎癥細胞因子水平,ELISA法檢測NGF、GDNF細胞因子水平;腸組織標本測量長度并進行結(jié)腸大體損傷程度(CMDI)評分,HE染色并進行組織損傷程度(HS)評分,觀察從潰瘍性結(jié)腸炎炎癥-不典型增生-腫瘤演進過程中的病理變化并統(tǒng)計成瘤率和瘤體數(shù)目(≥2mm)。免疫組化法檢測GFAP、S100β及PGP9.5等蛋白的表達,Western Blot法檢測腸組織NF-κB、IKKβ、PI3K、AKT、PTEN及ZO-1等蛋白的表達。2利用Transwell小室共培養(yǎng)EGC和IEC-6細胞,在共培養(yǎng)系統(tǒng)加入TNF-a和IL-6細胞因子(30ug/ml)進行干預(yù),通過熒光素滲漏實驗檢測EGC對IEC-6單層細胞屏障功能的影響,BrdU摻入法檢測EGC對IEC-6細胞增殖的影響,流式細胞術(shù)檢測EGC對IEC-6細胞周期及凋亡的影響,Western Blot法檢測EGC對IEC-6細胞Caspase-3、Bcl-2、E-Cadherin及ZO-1等蛋白表達的影響。結(jié)果1體內(nèi)實驗結(jié)果:1)DAI評分:與正常對照組對比,模型組DAI評分1W(0.67±0.62 vs 0)、4W(0.80±0.73 vs 0)、7W(1.00±0.85 vs 0)、9W(0.67±0.47 vs 0.07±0.15)、12W(0.93±0.43 vs 0.20±0.18)、15W(1.13±0.18 vs 0.20±0.45)及20W(1.53±0.30 vs 0.07±0.15)均升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);實驗組與條件對照組對比各時間點差異均無統(tǒng)計學意義。2)cmdi評分:與正常對照組對比,模型組cmdi評分1w(0.56±0.47vs0)、4w(2.37±1.57vs0)、7w(3.56±1.65vs0)、9w(2.86±0.99vs0)、12w(2.02±1.24vs0)、15w(3.26±1.13vs0)及20w(3.88±0.90vs0)均升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);實驗組與條件對照組對比7w(1.32±1.38vs3.96±1.49,p0.01),20w(2.63±0.64vs3.83±0.80,p0.05)減低,其余各時間點差異均無統(tǒng)計學意義。3)hs評分:與正常對照組對比,模型組hs評分各時間點均升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);實驗組與條件對照組對比4w(8.84±1.10vs10.66±1.25,p0.05),7w(10.32±1.58vs13.96±2.49,p0.05)減低,其余各時間點差異均無統(tǒng)計學意義。4)結(jié)直腸長度:與正常對照組對比,模型組除3w(8.82±0.95vs9.56±0.66,p0.05)外其余時間點結(jié)直腸長度均明顯縮短,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。實驗組與條件對照組對比各時間點差異均無統(tǒng)計學意義。5)成瘤率及瘤體數(shù)目(≥2mm):實驗組、條件對照組和模型組均從第6周末開始出現(xiàn)重度不典型增生及癌變,第6w成瘤率為50%,隨時間延長逐漸升高,至第20w均達100%。第15w腫瘤數(shù)目(≥2mm)實驗組vs條件對照組:3.17±1.72vs5.83±2.04,p0.05;第20w腫瘤數(shù)目(≥2mm)實驗組vs條件對照組:2.67±1.37vs5.67±2.58,p0.05。其余時間點差異無統(tǒng)計學意義。6)抗體芯片結(jié)果顯示:第4w開始實驗組血清細胞因子timp-1(a/b由4w5.99倍降至20w0.00倍),m-csf(a/b由4w3.48倍降至20w0.42倍),g-csf(a/b由4w3.48倍降至20w0.39倍),il-6(a/b由4w2.60倍降至20w0.44倍)逐漸降低。而mip-1a(a/b由4w1.00倍升高至20w67.32倍),il-2(a/b由4w078倍升高至20w3.67倍),blc(a/b由4w1.30倍升高至20w2.95倍)逐漸升高。7)elisa法檢測gdnf和ngf結(jié)果顯示:實驗組ngf在第4、9、15及20周較條件對照組升高(p0.05),gdnf從第6周開始較條件對照組均升高(p0.05)。8)免疫組化結(jié)果顯示:模型組vs正常對照組6wgfap、s100β表達降低(p0.05),7wpgp9.5表達降低(p0.05),9wgfap表達降低(p0.05)。實驗組與條件對照組對比20wgfap和s100β表達升高(p0.05),其余時間點差異無統(tǒng)計學意義。9)westernblot結(jié)果顯示:4w和6w實驗組vs條件對照組zo-1表達升高(p0.05)。其余時間點各組之間差異無統(tǒng)計學意義。PTEN-PI3K/AKT:4W-6W實驗組PTEN表達升高,而PI3K和AKT表達降低;7W實驗組PTEN表達升高,而PI3K和AKT表達均降低。15W實驗組vs條件對照組PTEN表達升高(p0.01),而PI3K表達降低(p0.05)。IKKβ/NF-κB:實驗組vs條件對照組6W IKKβ表達降低(p0.05),NF-κB表達無明顯差異;7W NF-κB表達降低(p0.01),IKKβ表達降低(p0.01)。2體外實驗結(jié)果1)熒光素滲漏試驗結(jié)果:IEC-6+IL-6+EGC vs IEC-6+IL-6(724.33±22.08 vs1451.50±36.18,p0.01),IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a(1261.17±53.08vs 2623.50±62.77,p0.01)下室熒光素量均減少。2)BrdU摻入實驗檢測IEC-6細胞增殖:IEC-6+IL-6+EGC vs IEC-6+IL-6(0.168±0.075 vs 0.023±0.015,p0.05)IEC-6細胞增值率升高,其余各組之間差異無統(tǒng)計學意義。3)流式細胞術(shù)檢測IEC-6細胞凋亡:EGC與IEC-6共培養(yǎng),以及加入TNF-α和IL-6后共培養(yǎng)IEC-6細胞早期凋亡率均減低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。4)流式細胞術(shù)檢測IEC-6細胞周期結(jié)果顯示:IEC-6+IL-6+EGC vs IEC-6+IL-6 G0/G1期細胞數(shù)增加(p0.05)而S期細胞數(shù)減少(p0.01)。IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a S期細胞數(shù)減少(p0.05)而G0/G1期細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。5)Western Blot結(jié)果顯示:IEC-6+IL-6+EGC vs IEC-6+IL-6 ZO-1和E-cadherin表達升高(p0.01),而IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a ZO-1和E-cadherin表達差異無統(tǒng)計學意義。IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a Bcl-2表達升高(p0.05),而在共培養(yǎng)體系加入IL-6 Bcl-2表達無差異。結(jié)論1成功構(gòu)建AOM/DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌實驗動物模型。2在結(jié)腸炎炎癥-腫瘤序列演進過程中,EGC可降低血清炎癥細胞因子水平,升高血清NGF、GDNF水平,其機制可能與其抑制IKKβ/NF-κB有關(guān)。此外,可能通過調(diào)控PTEN-PI3K/AKT途徑抑制上皮細胞凋亡,增加ZO-1表達從而降低腸粘膜通透性,減緩炎癥-不典型增生-癌變的進程。3體外研究結(jié)果顯示EGC可以促進腸上皮細胞的增殖,抑制其凋亡,并且通過促進緊密連接蛋白ZO-1和E-cadherin的表達維護腸粘膜屏障的完整性。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R574.62;R735.34

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