本文關(guān)鍵詞：NAFLD體外模型中調(diào)控脂肪代謝相關(guān)蛋白的鑒定和作用機(jī)制研究

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【摘要】：非酒精性脂肪肝(NAFLD)是最常見(jiàn)的一種肝臟慢性疾病,會(huì)導(dǎo)致一系列的肝損傷,包括脂肪變性、脂肪性肝炎、脂肪纖維化和肝硬化等癥狀。然而,NAFLD發(fā)病的分子機(jī)制仍不清楚。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是對(duì)細(xì)胞或機(jī)體中蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的組學(xué)研究,其將為深入研究NAFLD提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本文研究的目的是希望通過(guò)蛋白組學(xué)技術(shù)在高脂誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中識(shí)別差異表達(dá)蛋白,進(jìn)而研究其分子作用機(jī)制。這些結(jié)果將為未來(lái)NAFLD的預(yù)防和治療提供潛在的研究靶點(diǎn)。具體的工作內(nèi)容如下：(1) NAFLD體外模型的建立及相關(guān)調(diào)控蛋白的篩選鑒定：針對(duì)NAFLD發(fā)病過(guò)程中脂質(zhì)富集特征,構(gòu)建體外NAFLD細(xì)胞模型。選取外源脂肪酸OA處理SMMC-7721細(xì)胞系,對(duì)細(xì)胞增殖、脂質(zhì)積累情況進(jìn)行測(cè)定,篩選誘導(dǎo)劑合適的作用時(shí)間和作用濃度,發(fā)現(xiàn)在1mMOA處理24h時(shí)作用效果最好。然后通過(guò)雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析方法作用于對(duì)照組和OA處理組,獲得二維圖譜,蛋白點(diǎn)質(zhì)譜分析,通過(guò)q-PCR和western blot技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)在650個(gè)差異蛋白點(diǎn)中篩選出15個(gè)2倍表達(dá)差異的蛋白點(diǎn),7個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)(CALR、 Lamin B1、Glycine-tRNAligase、EEF1G、TPI1、PGK1、EIF3I),8個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)(CALU、 TPM4、KCIP-1、Annexin A5、HSP90、HSP70、plastin-3、Actin-2),其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控占53.4%,參與代謝過(guò)程13.3%,細(xì)胞骨架20%,細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)13.3%。表明NAFLD的發(fā)病過(guò)程涉及到不同功能性表達(dá)的蛋白。根據(jù)蛋白表達(dá)倍數(shù)差異,選擇變化最顯著的CALR蛋白作為下一步實(shí)驗(yàn)對(duì)象。(2) CALR脂代謝功能研究：應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對(duì)CALR的細(xì)胞定位進(jìn)行顯微鏡檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均有表達(dá)；應(yīng)用Fluo-3-Am熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)技術(shù),發(fā)現(xiàn)鈣離子在其中并沒(méi)有差異性改變。應(yīng)用siRNA干擾技術(shù),對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中的CALR基因敲減,發(fā)現(xiàn)在24h和48h表達(dá)水平均有明顯下調(diào),CD36和PPAR-a mRNA和蛋白水平表達(dá)增加。構(gòu)建pcDNATM3.1(+)-CALR質(zhì)粒,通過(guò)瞬時(shí)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞使CALR基因過(guò)表達(dá),發(fā)現(xiàn)在24h和48h CALR蛋白和基因均有明顯上調(diào),CD36和PPAR-a mRNA和蛋白水平表達(dá)下調(diào)。在外源OA誘導(dǎo)下,油紅0染色發(fā)現(xiàn)CALR促進(jìn)脂質(zhì)積累。以上結(jié)果表明CALR通過(guò)影響CD36和PPAR-a從而促進(jìn)脂肪積累,在這個(gè)過(guò)程中不涉及鈣離子變化。(3)吉非羅齊的細(xì)胞降脂機(jī)制研究：吉非羅齊,作為PPARa激活劑,是臨床中降血脂的藥物,但有關(guān)它的細(xì)胞降脂機(jī)制尚不清楚。利用已構(gòu)建的NAFLD細(xì)胞模型,通過(guò)油紅O染色、TLC實(shí)驗(yàn),首先研究了吉非羅齊的細(xì)胞降脂作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)50μM吉非羅齊對(duì)細(xì)胞沒(méi)有殺傷,但是可以降低細(xì)胞中總脂、甘油三酯水平。然后檢測(cè)了吉非羅齊對(duì)細(xì)胞中脂代謝通路中關(guān)鍵基因CD36、SREBP1、PPARa mRNA和相應(yīng)蛋白質(zhì)水平的改變,發(fā)現(xiàn)吉非羅齊可以上調(diào)PPARa和SREBP1蛋白表達(dá),而對(duì)CD36沒(méi)有顯著影響。對(duì)PPARa和SREBP1下游相關(guān)的LIPIN1、DGAT2、CPT2等基因進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)吉非羅齊通過(guò)促進(jìn)脂代謝氧化途徑和合成途徑參與脂代謝。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575

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本文編號(hào)：1182247