本文關(guān)鍵詞：Th22細胞及IL-22與肝纖維化關(guān)系的初步研究

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【摘要】：肝纖維化發(fā)病過程以細胞外基質(zhì)異常增生和過度沉積為特征,機體的免疫系統(tǒng)在其中也扮演著重要角色。Th22細胞是一種新發(fā)現(xiàn)的CD4+T輔助細胞亞群,以分泌IL-22為特征。研究表明,Th22細胞參與了人和動物多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程。目前動物實驗及臨床研究均提示Th22細胞亞群及其效應(yīng)分子IL-22可能參與了肝纖維化的發(fā)病過程。但在肝纖維化發(fā)病過程中Th22細胞的變化規(guī)律如何?相關(guān)細胞因子變化及其相互關(guān)系如何?目前無相關(guān)研究。為進一步了解Th22細胞在肝纖維化發(fā)病過程中的變化,闡明Th22細胞及IL-22在肝纖維化中的作用、尋求肝纖維化新的治療,本課題應(yīng)用BALB/C小鼠腹腔注射CCL4建立肝纖維化小鼠模型,及予IL-22干預(yù)肝星狀細胞,進行以下三方面研究。第---部分Th22及相關(guān)因子在肝纖維化小鼠中的動態(tài)變化目的：觀察小鼠肝纖維化發(fā)病過程中Th22細胞及其相關(guān)細胞因子IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-α的動態(tài)演變,探討Th22細胞及其細胞因子在肝纖維化中的作用及意義。方法：雄性Balb/c小鼠72只,體重22-25g,隨機(按隨機數(shù)字表法)分為模型組(n=40)和對照組(n=32)。兩組小鼠均設(shè)0(注射前)、4、8、12周4個時點亞組,模型組的每個時點亞組10只。對照組的每個時點亞組8只。對照組腹腔內(nèi)注射橄欖油,2mg/kg體重,每周2次；模型組腹腔內(nèi)注射CCL4,濃度20%,2mg/kg體重,每周2次,各組小鼠在規(guī)定時點處死；HE和Masson染色觀察小鼠肝臟病理改變并根據(jù)Ishak評分系統(tǒng)評估肝纖維化的程度；免疫組織化學(xué)染色檢測肝臟組織中α-平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)及IL-22的表達；流式細胞術(shù)(FCS)檢測小鼠脾Th22細胞數(shù)變化RT-PCR檢測肝臟組織Th22相關(guān)細胞因子IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-amRNA的表達,ELISA檢測血漿中IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-a蛋白的表達。結(jié)果：(1)肝組織病理切片HE染色顯示：隨著造模時間的延長,肝細胞變性、壞死,逐漸形成纖維間隔,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,最終形成假小葉。Masson染色鏡下觀察可見模型組的肝組織匯管區(qū)、中央靜脈大量膠原纖維沉積,肝小葉被寬窄不一的纖維間隔分割。(2)免疫組織化學(xué)染色分析結(jié)果顯示：隨造模時間的延長,模型組a-SMA表達量逐漸增加,除0周時點外,模型組其他時點a-SMA蛋白表達量均高于對照組(P0.01)。(3)流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示：模型組小鼠第4周時脾臟Th22細胞比例開始升高,并一直持續(xù)至12周。除0周時點外,模型組Th22細胞比例均高于對照組的相應(yīng)時點(P0.01)。(4)模型組小鼠第4周時肝臟組織IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-amRNA的表達量開始升高,并一直持續(xù)至12周。除0周時點外,模型組的肝組織IL-22、IL-17A、IFN-y、IL-6和TNF-amRNA的表達量均高于對照組的相應(yīng)時點(P0.01)。(5)模型組小鼠第4周時外周血IL-22、TL-11A、IFN-γ、IL-6和TNF-a蛋白的表達量開始升高,并一直持續(xù)至12周。除0周時點外,模型組的外周血IL-22、IL-17A、IFN-γ IL-6和TNF-a的表達量均高于對照組的相應(yīng)時點(P0.01)。(6)模型組小鼠第4周時肝臟組織IL-22蛋白的表達量開始升高,并一直持續(xù)至12周。除0周時點外,模型組的肝組織IL-22的表達量均高于對照組的相應(yīng)時點(P0.01)。結(jié)論：Th22及相關(guān)細胞因子在肝纖維化小鼠中呈高表達。第二部分重組IL-22抑制小鼠肝纖維化的體內(nèi)研究目的：觀察體內(nèi)重組IL-22對肝纖維化小鼠的干預(yù)作用,從而進一步確定Th22細胞及其效應(yīng)因子IL-22在肝纖維化中的作用。方法：6周齡雄性BABL/c小鼠16只均腹腔注射20%CCL4,每周2次,在造模后第8周起,隨機分成2組：重組IL-22組(n=8,rmIL-22組)和對照組(n=8,carrier組)。重組IL-22和carrier組小鼠分別腹腔注射0.3μg/grm1L-22和等體積溶劑0.5%BSA(in PBS, pH7.0),每天1次,一直到第10周。第10周時處死小鼠,并收集外周血、血漿、脾臟及肝臟組織等標本；HE和Masson染色了解肝臟病理改變及根據(jù)Ishak評分系統(tǒng)評估肝纖維化的程度；免疫組織化學(xué)染色檢測肝臟組織中α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和IL-22的表達；RT-PCR檢測小鼠肝臟組織IL-22、IL-22R1、IL-10R2、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-amRNA的表達,ELISA檢測血漿中IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-a蛋白表達、FCS檢測兩組小鼠脾臟Th22細胞數(shù)變化。結(jié)果：(1)與對照組相比,重組IL-22可改善肝纖維化小鼠的肝纖維化,程度、降低肝纖維化病理積分,減少肝臟中a-SMA蛋白的表達(P0.05)。(2)與對照組相比,重組IL-22降低脾Th22亞群細胞的增殖,同時減少小鼠肝臟組織中IL-22蛋白和血漿中IL-22蛋白的水平,并降低肝臟組織IL-22、IL-22R1和IL-10R2mRNA的表達(P0.05)。(3)與對照組相比,重組IL-22降低小鼠血漿中IL-17A、IFN-y、TNF-a和IL-6蛋白的水平及降低肝臟組織IL-17A、IFN-γ、TNF-α和IL-6 mRNA的表達(P0.05)。結(jié)論：IL-22通過抑制HSC活性及炎癥因子改善肝纖維化。第三部分重組IL-22抑制肝星狀細胞增殖的體外研究目的：研究重組IL-22對肝星狀細胞(HSCs)增殖和活化的影響及其對纖維化相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用。方法：將SD大鼠原代肝星狀細胞(HSCs)分為3組,①對照組：HSCs單獨培養(yǎng)；②實驗組a：重組IL-22(10ng/ml)干預(yù)HSCs;③實驗組b：重組IL-22(20ng/ml)干預(yù)HSCs。各組分別培養(yǎng)24h、48h和72h,于倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察細胞形態(tài)學(xué)的變化；免疫組化法檢測HSCs中α-平滑肌蛋白(a-SMA)的表達量；四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測IL-22對HSCs的最佳干預(yù)濃度；熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測HSCs中a-SMA、 TGF-β1和TIMP-1mRNA的表達水平。結(jié)果：1.倒置相差顯微鏡下觀察,可見狀態(tài)良好的HSCs呈膜狀生長,呈典型的星形或多邊形,胞內(nèi)較多顆粒。免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果顯示：培養(yǎng)48h的HSCs可見胞漿內(nèi)棕黃色顆粒,即α-肌動蛋白表達陽性,95%以上的活化的HSCs呈陽性表達。2.與對照組相比,不同濃度的IL-22在24h、48h和72h后對肝星狀細胞均有抑制作用(P0.05),濃度為20 ng/ml時肝星狀細胞的抑制作用最明顯,與其他各濃度比較,統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異(P0.05)。3.實驗組的a-SMA. TGF-β1和TIMP-1mRNA表達量隨著培養(yǎng)時間延長而降低,比對照組的相應(yīng)時間段表達量低,統(tǒng)計學(xué)有顯著差異P0.05)。結(jié)論：IL-22通過抑制HSC增殖及活化降低促纖維化因子水平。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2

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