本文關(guān)鍵詞：以減毒沙門氏菌為載體的H5N1流感疫苗及乙肝基因治療藥物研究

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【摘要】：由于減毒腸道細菌如沙門氏菌,具有通過口服并入侵宿主細胞的特性,減毒沙門氏菌作為核酸疫苗傳遞載體非常具有應(yīng)用前景。在本研究中,我們構(gòu)建了一株新型減毒沙門氏菌SL368,并將其作為載體傳遞和表達高致病性H5N1流感病毒的血凝素(HA)基因和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因,即沙門氏菌流感疫苗Sal-HA-NA。結(jié)果表明,我們構(gòu)建的減毒沙門氏菌SL368表現(xiàn)出較高的基因傳遞效率以及對小鼠的低細胞毒性和低致病性。以BALB/c小鼠作為動物模型,我們研究了Sal-HA-NA的免疫效果。結(jié)果顯示,通過口服免疫接種,Sal-HA-NA誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了抗HA血清IgG、粘膜IgA以及分泌干擾素γ的T細胞。同時口服接種表達病毒HA和NA蛋白沙門氏菌流感疫苗的小鼠經(jīng)過高致病性H5N1流感病毒以及H1N1流感病毒攻毒后全部存活下來,而口服接種攜帶空載質(zhì)粒的沙門氏菌的小鼠全部死亡。這些結(jié)果表明Sal-HA-NA誘導(dǎo)機體產(chǎn)生了強烈的特異性體液和細胞免疫反應(yīng),并使機體獲得了抵抗多種流感病毒的能力。此外,我們的研究還表明發(fā)展以減毒沙門氏菌為載體的新型口服疫苗抵抗流感病毒具有可行性。肝臟特異性的miR-122已被證實能夠通過堿基配對的方式與乙肝病毒高度保守的前基因組RNA序列結(jié)合,進而抑制乙肝病毒基因的表達和復(fù)制。然而,在哺乳動物細胞中,miR-122的瞬間沉默效應(yīng)和細胞毒性限制了其在治療乙肝病毒感染方面的應(yīng)用潛力。在本研究中,我們基于在細胞內(nèi)指導(dǎo)合成siRNA樣轉(zhuǎn)錄體的pSuper basic載體構(gòu)建pSB-miR-122質(zhì)粒,來持續(xù)表達miR-122延長抑制HBV基因表達的時間。同時用一種新型減毒沙門氏菌將pSB-miR-122質(zhì)粒高效地帶入肝臟細胞,大量表達miR-122,并且對小鼠無副作用。此外,口服接種表達miR-122沙門氏菌藥物的小鼠體內(nèi)乙肝病毒基因的表達受到了抑制。這些結(jié)果表明,表達miR-122的沙門氏菌藥物介導(dǎo)的基因療法可以抑制體內(nèi)乙肝病毒基因的表達。
【關(guān)鍵詞】：沙門氏菌 流感疫苗 miR-122 乙肝病毒
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392;R512.62
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 第一章 前言14-42
• 1.1 胞內(nèi)菌作為活疫苗載體的研究概況14-26
• 1.1.1 減毒活疫苗載體在預(yù)防感染性疾病和治療癌癥中的應(yīng)用14-17
• 1.1.2 沙門氏菌毒力與沙門氏菌免疫17-20
• 1.1.3 沙門氏菌作為載體傳遞異源抗原20-23
• 1.1.4 沙門氏菌作為活疫苗載體的應(yīng)用23-25
• 1.1.5 沙門氏菌載體在抗腫瘤治療中的應(yīng)用25-26
• 1.2 流感病毒概述26-34
• 1.2.1 A型流感病毒的宿主范圍27-28
• 1.2.2 A型流感病毒的進化28-30
• 1.2.3 A型流感病毒的致病機理30
• 1.2.4 流感病毒感染的社會影響和防治措施30-31
• 1.2.5 流感疫苗31-34
• 1.3 乙肝病毒概述34-40
• 1.3.1 乙肝病毒感染引起的疾病及藥物治療36-37
• 1.3.2 乙肝病毒感染的基因治療37-38
• 1.3.3 基因療法抵御乙肝病毒的作用機理38-40
• 1.4 研究目的與意義40-42
• 第二章 實驗材料和實驗方法42-61
• 2.1 生物材料42
• 2.2 實驗設(shè)備和儀器42-43
• 2.3 實驗材料和試劑43-44
• 2.3.1 分子生物學(xué)相關(guān)實驗材料和試劑43
• 2.3.2 細胞生物學(xué)相關(guān)實驗材料和試劑43-44
• 2.3.3 蛋白質(zhì)分析相關(guān)實驗材料和試劑44
• 2.3.4 病毒學(xué)與動物學(xué)相關(guān)實驗材料和試劑44
• 2.4 分子克隆實驗44-49
• 2.4.1 大腸桿菌DH5α化轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的制備及使用44-45
• 2.4.2 Red重組法構(gòu)建沙門氏菌缺失突變株SL368和SL30145-46
• 2.4.3 沙門氏菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的制備及使用46-47
• 2.4.4 質(zhì)粒的提取47
• 2.4.5 抗生素的配制47-48
• 2.4.6 限制性酶切和PCR實驗48-49
• 2.5 細胞水平相關(guān)實驗49-52
• 2.5.1 細胞傳代培養(yǎng)49-50
• 2.5.2 細胞轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法)50-51
• 2.5.3 沙門氏菌感染細胞51
• 2.5.4 收獲細胞51
• 2.5.5 RNA的提取51-52
• 2.6 蛋白質(zhì)水平實驗52-53
• 2.6.1 SDS-PAGE及Western-blot52-53
• 2.7 病毒學(xué)相關(guān)實驗53-55
• 2.7.1 流感病毒的增殖53-54
• 2.7.2 流感病毒滴度測定54-55
• 2.7.3 流感病毒的保存55
• 2.8 動物學(xué)及免疫學(xué)相關(guān)實驗55-61
• 2.8.1 動物的免疫及攻毒55-56
• 2.8.2 酶聯(lián)免疫實驗(ELISA)56-57
• 2.8.3 小鼠脾細胞分離57-58
• 2.8.4 酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISPOT)58-59
• 2.8.5 血凝抑制實驗59
• 2.8.6 HE染色實驗59-60
• 2.8.7 免疫組化實驗60-61
• 第三章 以減毒沙門氏菌為載體的新型口服流感疫苗及其免疫效力的研究61-79
• 3.1 研究背景61-63
• 3.2 實驗結(jié)果63-76
• 3.2.1 沙門氏菌口服流感疫苗Sal-HA-NA的構(gòu)建63-66
• 3.2.2 Sal-HA-NA介導(dǎo)流感病毒抗原蛋白在細胞、小鼠體內(nèi)傳遞和表達66-70
• 3.2.3 Sal-HA-NA能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答和黏膜免疫應(yīng)答70-71
• 3.2.4 Sal-HA-NA能夠有效增強小鼠特異性細胞免疫應(yīng)答71-72
• 3.2.5 Sal-HA-NA能夠提高小鼠針對H5N1亞型和H1N1亞型流感病毒感染的免疫保護72-76
• 3.3 討論76-79
• 第四章 以減毒沙門氏菌為載體的新型乙肝治療藥物的研究79-89
• 4.1 研究背景79-80
• 4.2 實驗結(jié)果80-86
• 4.2.1 miR-122在小鼠體內(nèi)可有效抑制乙肝病毒基因的表達80-82
• 4.2.2 以減毒沙門氏菌為載體的乙肝治療藥物Sal-miR122的構(gòu)建82-83
• 4.2.3 miR-122通過減毒沙門氏菌SL301介導(dǎo)在細胞內(nèi)的傳遞和表達83-85
• 4.2.4 Sal-miR122能夠有效抑制小鼠體內(nèi)乙肝病毒基因的表達85-86
• 4.3 討論86-89
• 研究總結(jié)89-90
• 參考文獻90-108
• 縮略詞表108-110
• 攻讀博士期間的學(xué)術(shù)成果110-111
• 致謝111

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