本文關(guān)鍵詞：高遷移率族蛋白1在肝臟胰島素抵抗中的作用及其機制研究

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【摘要】：第一章 HMGB1在高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟胰島素抵抗中的作用及其機制研究目的：研究高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)在高脂誘導肝臟胰島素抵抗中的作用及其可能機制。方法：動物實驗：1、C57/BL6雄性小鼠,分別高脂喂養(yǎng)0周、4周、8周、12周后,隔夜禁食12小時處死,留取各組小鼠的血清及肝臟組織。實驗過程中,每4周測空腹血糖,干預(yù)第12周行腹腔葡萄糖耐量試驗(IPGTT)及腹腔胰島素耐量試驗(IPITF)；2、使用ELISA試劑盒檢測不同高脂喂養(yǎng)周數(shù)小鼠血清HMGB1水平；3、提取肝臟組織蛋白,運用West ern Blot、免疫組化的方法檢測各組小鼠組織中HMGB1、胰島素通路關(guān)鍵分子、NF-κB炎癥通路蛋白表達水平。細胞實驗：1、HepG2細胞不同時間梯度棕櫚酸(PA)處理后檢測胰島素通路關(guān)鍵分子、培養(yǎng)基和細胞內(nèi)HMGB1水平以及NF-κB炎癥通路表達；2、檢測不同濃度rhHMGB1干預(yù)后胰島素通路以及炎癥通路關(guān)鍵蛋白的表達水平結(jié)果：動物實驗：1、隨著高脂喂養(yǎng)周數(shù)的增加,小鼠空腹血糖較相應(yīng)的普食對照組有逐步增加的趨勢,并且在第12w開始有統(tǒng)計學意義(高脂12w組(7.83±0.51)mmol/L VS普食12W組±5.34±0.55)mmol/L,t=3.311,P=0.016);在高脂喂養(yǎng)第12W,IPGTT實驗顯示,注射葡萄糖30 min、60 min.120min時,高脂組血糖與普食組相比顯著升高,且高脂組血糖曲線下面積(AUC)顯著高于普食組(t=-7.295,P=0.002) ； IPITT實驗顯示,經(jīng)過12W的高脂飲食處理,高脂組血糖曲線下面積明顯增加(t=-10.216,p=0.001)；測定HFD-12W血清胰島素水平發(fā)現(xiàn)相較與普食組出現(xiàn)明顯的高胰島素血癥,HOMA-IR同樣顯著增加(t=-10.216, p=0.001)。2. ELISA檢測不同高脂喂養(yǎng)時程血清HMGB1含量,結(jié)果顯示隨著高脂周數(shù)的增加,小鼠血清HMGB1含量呈現(xiàn)遞增趨勢,并且HFD-12W較HFD-OW組有明顯上升(t=-3.085, p=0.037)；肝臟western blot結(jié)果示不同實驗周數(shù)的小鼠肝臟HMGB1蛋白表達量也呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢,在第8W、12W較對照組有統(tǒng)計學意義(p0.05),肝臟HMGB1免疫組化同樣驗證以上結(jié)果。3、肝臟TLR4、RAG1蛋白表達量在實驗的第八周以及八周之后出現(xiàn)較基線水平明顯增加：分別提取肝臟細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)的P65,結(jié)果示高脂8W、12W可明顯增加P65入核數(shù)量和比例(p0.－5)。細胞實驗：1、PA處理HepG2細胞20h、21h后p-AKT、水平較0h組下降,并有統(tǒng)計學意義；細胞培養(yǎng)基上清液檢測HMGB1發(fā)現(xiàn)PA處理后HMGB1的濃度有一定的增加趨勢,并且在20h.24h PA處理組明顯增加(p0.05)；HMGB1蛋白表達量在PA處理第8h開始就有明顯的增加趨勢(p0.05)；肝臟TLR4表達量在PA處理第16h后出現(xiàn)有統(tǒng)計學意義的增加,RAGE蛋白的表達在PA處理第8h后即有統(tǒng)計學意義的提高,然而炎癥通路關(guān)鍵分子P65的磷酸化激活明顯增多出現(xiàn)在PA處理的第20h、2qh。2.100ng/ml、200ng/ml、 500ng/ml的rhHMGB1處理HepG2細胞24h后,p-IRS2(ser731)表達量明顯增加(p0.05)。200ng/m l和500 ng/ml處理組的p-AKT表達量較CON組顯著減少(p0.05)； 100 ng/ml、00ng/ml及500ng/ml的濃度作用24h后肝臟細胞內(nèi)的炎癥通路出現(xiàn)明顯的活化(p0.05)。結(jié)論：HMGB1在肝臟胰島素抵抗中可能扮演重要的始動因素,其可能通過結(jié)合胞外受體RAGE\TLR4激活NF-κB炎癥通路進而發(fā)揮上述生物學功能。第二章細胞內(nèi)HMGB1在PA誘導的胰島素抵抗中的作用及其機制研究目的：研究細胞內(nèi)HMGB1在PA誘導肝臟胰島素抵抗中的作用及其可能機制。方法：1、慢病毒過表達HepG2細胞內(nèi)HMGBA1后檢測胰島素通路關(guān)鍵分子、培養(yǎng)基和細胞內(nèi)HMGBA1水平以及NF-κB炎癥通路情況；2、使用小干擾技術(shù)下調(diào)細胞內(nèi)HMGBl后,PA處理24h,提取nRNA、蛋白以及留收培養(yǎng)基上清,檢測HMGB1.胰島素通路變化；3、使用r11MGB1處理HepG2細胞內(nèi)下調(diào)或不下調(diào)HMGB1 24h后,檢測胰島素通路的變化情況4.300umol/L PA處理下調(diào)HMGB1的HepG2細胞24h后,檢測自噬活性的變化。結(jié)果：1. HMGB1過表達組與300uM PA處理組(PA組)有相似的蛋白表達水平(t=-1.363,p=0.245)。檢測胰島素通路關(guān)鍵分子IRS-2.AKT以及其磷酸化狀況結(jié)果均提示：相較CON組,PA處理后引起的明顯胰島素抵抗,然而HMGBA1 OE組并未出現(xiàn)顯著的變化。2、使用小干擾技術(shù)特異性下調(diào)HepG2細胞內(nèi)HMGB1的表達后,300uM PA處理該組細胞24小時,可見胰島素關(guān)鍵分子AKT、IRS2受損呈現(xiàn)加重趨勢。與此同時,ELsA檢測培養(yǎng)基上清HMGB1含量發(fā)現(xiàn)干擾組HMGB1含量較正常對照組并無明顯變化。B、rhHMGB1干預(yù)結(jié)果提示：rHMGB1+siRNA-HMGB1處理組相較單純rHMGB1組IRS2抑制性磷酸化位點ser731明顯增加,AKT活性磷酸化明顯下降。4、PA干預(yù)1lepG2 24小時后,自噬標志性指標LC38Ⅱ/LC3B Ⅰ顯著下降,當下調(diào)HMGB1表達后相同方式處理24h,細胞自噬水平較PA組明顯下降。RT-PCR方法檢測自噬相關(guān)基因結(jié)果示：與PA組相比,atg3、atg4/atg7 mRNA水平均出現(xiàn)統(tǒng)計學意義的下降(p0.05)。結(jié)論：細胞內(nèi)HMGB1在PA誘導的肝臟胰島素抵抗中可能發(fā)揮保護作用,可能與細胞內(nèi)HMGB1參與自噬調(diào)控有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：HMGB1 胰島素抵抗 炎癥 肝臟 HMGB1 胰島素抵抗 炎癥 肝臟 自噬
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 第一章 HMGB1在高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟胰島素抵抗中的作用及其機制研究13-36
• 第一部分 前言13-14
• 第二部分 實驗材料與方法14-24
• 第三部分 實驗結(jié)果24-31
• 第四部分 討論31-34
• 第五部分 參考文獻34-36
• 第二章 細胞內(nèi)HMGB1在PA誘導的胰島素抵抗中的作用及其機制研究36-49
• 第一部分 前言36-37
• 第二部分 實驗材料與方法37-41
• 第三部分 實驗結(jié)果41-45
• 第四部分 討論45-47
• 第五部分 參考文獻47-49
• 結(jié)論49-50
• 第三章 文獻綜述50-56
• 參考文獻54-56
• 附錄56-57
• 致謝57-58

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本文編號：1107732