本文關(guān)鍵詞：根皮素和根皮素異煙酰基腙防治急性肝損傷活性及誘導人肝癌細胞凋亡機理研究

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【摘要】：急性肝損傷是一種極其常見的肝臟疾病,目前有效的臨床預防和治療方法是口服抗氧化劑和合理的藥物支持治療。急性肝損傷誘導因素主要有自由基、病毒、酒精、藥物和免疫等原因,而自由基氧化損傷通常是急性肝損傷的一種主要病因。研究表明人體內(nèi)活性氧(ROS)和自由基含量太高,容易引起肝細胞膜破壞和DNA損傷,進而導致急性肝損傷。因而,廣泛篩選安全有效的高活性抗氧化劑,研究其生物效應和作用機制,進而指導臨床合理用藥,具有重要的科學意義和應用前景。根皮素是具有二氫查爾酮類結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物,存在于蘋果、梨等果皮及根皮中以及多種蔬菜汁液中。已有研究表明,根皮素具有很好的抗氧化、抑制酪氨酸酶和抗癌活性等生物活性。具體如根皮素可抗氧化,淡化色斑,使皮膚增白,其效果優(yōu)于曲酸和熊果苷等,是目前化妝品中常用的美白劑;同時,根皮素還具有抗腫瘤、降血糖、保護血管等活性。但是,由于根皮素在自然狀態(tài)下很容易氧化變質(zhì),這極大地限制了它的應用范圍和活性發(fā)揮。對其適度修飾,希望在增加其穩(wěn)定性同時,能保存或提高其抗氧化和抑制酪氨酸酶活性能力,無疑是一項很有意義的工作。根皮素異煙�；甑暮铣珊拖嚓P(guān)活性研究便是基于這一思路進行的。目前有關(guān)根皮素抗氧化和抑制酪氨酸酶活性的研究較多,但研究根皮素及其化學修飾物根皮素異煙�；觐A防和治療急性肝損傷和抗癌作用機制的工作未見報道,基于此,本論文從這一方面展開了相關(guān)研究�；诒緦嶒炇业那捌诠ぷ鞣e累,本論文以槲皮素為參照物,研究了根皮素、根皮素異煙�；�(本實驗室合成和結(jié)構(gòu)表征)的抗氧化和抑制酪氨酸酶活性;分別采用常用的D-氨基半乳糖、硫代乙酰胺和對乙酰氨基苯酚造模,研究了根皮素和根皮素異煙�；陮π∈蠹毙愿螕p傷的保護作用。采用MTT法、流式細胞儀測定法、凝膠電泳法、蛋白印跡雜交和實時熒光定量PCR法,初步探索了根皮素和根皮素異煙�；暾{(diào)控人肝癌BEL-7402細胞增殖和凋亡作用機制。研究結(jié)果表明,就采用的抗氧化模型而言,根皮素和根皮素異煙�；昃哂辛己玫目寡趸钚�,而且根皮素異煙�；昊钚悦黠@優(yōu)于根皮素,甚至優(yōu)于陽性對照物槲皮素。而對于抑制酪氨酸酶二酚酶活性實驗而言,根皮素活性優(yōu)于根皮素異煙�；�。就研究的肝損傷模型而言,根皮素異煙�；昕寡趸螕p傷活性明顯優(yōu)于根皮素,甚至優(yōu)于陽性對照物槲皮素。關(guān)于調(diào)控人肝癌bel-7402細胞增殖和凋亡作用機制實驗,結(jié)果表明,根皮素和根皮素異煙�；陮el-7402細胞具有細胞毒性和誘導細胞凋亡作用。誘導bel-7402細胞凋亡的途徑,主要包括p53信號通路,bcl-2家族線粒體信號通路和由htert控制的端粒穩(wěn)定性。綜上所述,根皮素和根皮素異煙�；晔橇己玫目寡趸瘎┖屠野彼崦付用富钚砸种苿�,具有防治急性肝損傷的活性,對人肝癌bel-7402細胞具有細胞毒性和誘導細胞凋亡作用,是值得進一步研究的防治急性肝損傷的新型候選藥物。第一章:緒論首先介紹了根皮素,酰腙化合物和酪氨酸酶的研究現(xiàn)狀。然后介紹了急性肝損傷的病因、損傷機理,天然藥物抗急性肝損傷的研究進展。再介紹了人肝癌凋亡機理研究進展,主要包括目前研究較多的各種信號轉(zhuǎn)導通路和中藥黃酮類化合物誘導細胞凋亡的研究進展。第二章:研究了槲皮素、根皮素、根皮素異煙�；�、水飛薊賓抗氧化活性。研究方法包括清除dpph自由基、清除abts自由基,抑制體外肝臟線粒體脂質(zhì)過氧化活性,和抗氧化保護超螺旋pbr322質(zhì)粒dna。研究結(jié)果表明,根皮素異煙�；辍㈤纹に�、根皮素、水飛薊賓具有明顯的清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化活性,呈濃度依賴性效應,活性順序依次為根皮素異煙�；觊纹に馗に厮w薊賓。根皮素異煙�；甑捏w系終濃度ic50分別為2.5μmol/l、2.27μmol/l、2.08μmol/l。槲皮素的體系終濃度ic50分別為4.0μmol/l、3.64μmol/l、6.67μmol/l。根皮素的體系終濃度ic50分別為10.0μmol/l、4.54μmol/l、12.50μmol/l。水飛薊賓的體系終濃度ic50分別為125.0μmol/l、7.10μmol/l、104.16μmol/l。研究表明,根皮素異煙�；�、槲皮素和根皮素可以減少aaph誘導的超螺旋pbr322質(zhì)粒dna破壞程度,而且呈現(xiàn)明顯的劑量效應。抑制活性的排列順序為根皮素異煙�；觊纹に馗に��？傊�,研究結(jié)果表明,就采用的抗氧化模型而言,根皮素和根皮素異煙�；昃哂辛己玫目寡趸钚�,其中根皮素異煙�；昊钚詢�(yōu)于根皮素,甚至優(yōu)于陽性對照物槲皮素。第三章:研究了根皮素和根皮素異煙酰基腙抑制酪氨酸酶活性。以l-dopa為底物測定槲皮素、根皮素、根皮素異煙�；暌种评野彼崦付用富钚缘膇c50值,抑制的類型,并測定相應的抑制常數(shù)kI和kIS。試驗結(jié)果顯示,槲皮素、根皮素、根皮素異煙�；暌种评野彼崦付用富盍Φ膇c50值分別為25μmol/l,37.5μmol/l和50μmol/L(n=5,P0.05)�；钚皂樞驗殚纹に馗に馗に禺悷燉；�。根皮素和根皮素異煙酰基腙對酶活力的抑制作用表現(xiàn)為可逆抑制作用,而且為混合型可逆抑制,根皮素KI為23.5μmol/L,KIS為129.0μmol/L,根皮素異煙�；闗I為57.5μmol/L,KIS為187.1μmol/L。研究結(jié)果表明,根皮素和根皮素異煙�；昃哂泻芎玫囊种评野彼崦付用富钚�,是混合型可逆抑制,而且根皮素活性優(yōu)于根皮素異煙�；�。第四章:研究了槲皮素、根皮素和根皮素異煙�；陮π∈蠹毙愿螕p傷的保護作用。本試驗分別采用D-氨基半乳糖、硫代乙酰胺和對乙酰氨基苯酚造模,誘導小鼠急性肝損傷,再研究槲皮素、根皮素和根皮素異煙�；陮π∈蠹毙愿螕p傷的保護作用,通過血清學(ALT、AST、γ-GT、ALP和血清總膽紅素)、組織學方法,研究藥物對肝臟的生化反應和組織病理變化的影響。試驗結(jié)果表明,藥物處理組小鼠血清ALT、AST、γ-GT、ALP和血清總膽紅素明顯降低(P0.05),而且降低幅度呈現(xiàn)劑量依賴性�；钚皂樞驗楦に禺悷燉；觊纹に馗に�。預處理了根皮素、槲皮素和根皮素異煙�；甑男∈蟾谓M織病理學病變,得到了明顯改善。研究結(jié)果表明,槲皮素、根皮素和根皮素異煙�；陮π∈蠹毙愿螕p傷有顯著的保護作用,而且根皮素異煙�；昊钚悦黠@優(yōu)于根皮素,甚至優(yōu)于陽性對照物槲皮素。第五章:探索了根皮素和根皮素異煙�；暾T導人肝癌細胞凋亡的分子機理。本研究通過MTT法、流式細胞儀測定法、凝膠電泳法、蛋白印跡雜交和實時熒光定量PCR法,探索根皮素和根皮素異煙�；暾T導人肝癌細胞凋亡的分子機制�？偨Y(jié)機理,主要包括:抑制細胞增殖;作用于細胞周期的G0/G1期,阻滯細胞增殖,并促進細胞凋亡;降解基因組DNA;減少hTERT、p53和Bcl-2蛋白的表達量,增加Bax蛋白的表達量,減少hTERT基因的mRNA的表達量。結(jié)果表明,根皮素和根皮素異煙�；陮EL-7402細胞能產(chǎn)生細胞毒性和誘導細胞凋亡。參與BEL-7402細胞凋亡的途徑,包括內(nèi)在和外在的凋亡途徑,即p53的信號通路,Bcl-2家族線粒體信號通路和由hTERT控制的端粒穩(wěn)定性。實驗結(jié)果揭示了根皮素和根皮素異煙�；暾T導人肝癌細胞凋亡的部分分子機制,為根皮素和根皮素異煙�；暧米魅祟惛伟╊A防和化療藥物,奠定了實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：根皮素 根皮素異煙�；� 抗氧化活性 抑制酪氨酸酶活性 急性肝損傷 D-氨基半乳糖 硫代乙酰胺 對乙酰氨基苯酚 凋亡機理 人肝癌細胞 蛋白印跡雜交 實時熒光定量PCR
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-12
• 縮寫符號12-14
• 第一章 緒論14-37
• 1.1 根皮素研究概述14-15
• 1.2 酰腙類化合物研究概述15-16
• 1.3 酪氨酸酶研究概述16-17
• 1.4 急性肝損傷研究進展17-23
• 1.4.1 急性肝損傷的病因和損傷機理17-20
• 1.4.2 急性肝損傷的流行病學20
• 1.4.3 天然化合物抗急性肝損傷的研究進展20-23
• 1.5 人肝癌凋亡機理研究概述23-28
• 1.5.1 目前研究較多的各種肝癌信號轉(zhuǎn)導通路23-27
• 1.5.2 人肝癌細胞凋亡機理研究常見的幾種測定靶標27-28
• 1.6 課題來源28
• 1.7 主要研究內(nèi)容和創(chuàng)新點28-29
• 1.8 參考文獻29-37
• 第二章 根皮素和根皮素異煙�；昕寡趸钚匝芯�37-51
• 2.1 引言37-38
• 2.2 材料與方法38-41
• 2.3 結(jié)果與討論41-47
• 2.3.1 根皮素異煙�；甑谋碚�41-42
• 2.3.2 清除DPPH自由基試驗42-44
• 2.3.3 清除ABTS自由基試驗44
• 2.3.4 抑制體外肝臟線粒體脂質(zhì)過氧化試驗44-45
• 2.3.5 抗氧化保護超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA試驗45-47
• 2.4 結(jié)論47-48
• 2.5 參考文獻48-51
• 第三章 根皮素和根皮素異煙�；暌种评野彼崦富钚匝芯�51-59
• 3.1 引言51
• 3.2 材料與方法51-53
• 3.3 結(jié)果與討論53-57
• 3.3.1 化合物對酪氨酸酶二酚酶活力的影響53
• 3.3.2 化合物對酪氨酸酶活力的抑制作用機理53-54
• 3.3.3 化合物抑制酪氨酸酶活性類型和抑制常數(shù)的測定54-57
• 3.4 結(jié)論57
• 3.5 參考文獻57-59
• 第四章 根皮素和根皮素異煙�；攴乐渭毙愿螕p傷研究59-77
• 4.1 引言59-60
• 4.2 材料與方法60-62
• 4.3 結(jié)果與討論62-74
• 4.3.1 藥物對ALT、AST活性的影響62-63
• 4.3.2 藥物對 γ-GT和ALP活性的影響63-64
• 4.3.3 藥物對血清總膽紅素含量的影響64-65
• 4.3.4 組織病理學觀察65-74
• 4.4 結(jié)論74-75
• 4.5 參考文獻75-77
• 第五章 根皮素和根皮素異煙�；暾T導人肝癌細胞凋亡機理研究77-95
• 5.1 引言77
• 5.2 材料與方法77-81
• 5.3 結(jié)果與討論81-90
• 5.3.1 MTT法測定藥物處理對肝癌細胞增殖的影響81-82
• 5.3.2 流式細胞儀分析藥物處理對細胞周期的影響82-84
• 5.3.3 流式細胞儀分析藥物處理對熒光FITC標記的凋亡相關(guān)蛋白表達的影響84-85
• 5.3.4 凝膠電泳法檢測藥物處理對細胞的基因組DNA的影響85-87
• 5.3.5 檢測藥物處理組Bcl-2，，hTERT基因產(chǎn)物表達量和p53、Bax抑癌基因產(chǎn)物表達量變化87-89
• 5.3.6 檢測藥物處理對hTERT基因mRNA表達的影響89-90
• 5.4 結(jié)論90-92
• 5.5 參考文獻92-95
• 攻讀學位期間的研究成果95-96
• 致謝96

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8 孫s

本文編號：1103541