本文關(guān)鍵詞：根皮素和根皮素異煙�；攴乐渭毙愿螕p傷活性及誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)理研究

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【摘要】：急性肝損傷是一種極其常見(jiàn)的肝臟疾病,目前有效的臨床預(yù)防和治療方法是口服抗氧化劑和合理的藥物支持治療。急性肝損傷誘導(dǎo)因素主要有自由基、病毒、酒精、藥物和免疫等原因,而自由基氧化損傷通常是急性肝損傷的一種主要病因。研究表明人體內(nèi)活性氧(ROS)和自由基含量太高,容易引起肝細(xì)胞膜破壞和DNA損傷,進(jìn)而導(dǎo)致急性肝損傷。因而,廣泛篩選安全有效的高活性抗氧化劑,研究其生物效應(yīng)和作用機(jī)制,進(jìn)而指導(dǎo)臨床合理用藥,具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。根皮素是具有二氫查爾酮類(lèi)結(jié)構(gòu)的黃酮類(lèi)化合物,存在于蘋(píng)果、梨等果皮及根皮中以及多種蔬菜汁液中。已有研究表明,根皮素具有很好的抗氧化、抑制酪氨酸酶和抗癌活性等生物活性。具體如根皮素可抗氧化,淡化色斑,使皮膚增白,其效果優(yōu)于曲酸和熊果苷等,是目前化妝品中常用的美白劑;同時(shí),根皮素還具有抗腫瘤、降血糖、保護(hù)血管等活性。但是,由于根皮素在自然狀態(tài)下很容易氧化變質(zhì),這極大地限制了它的應(yīng)用范圍和活性發(fā)揮。對(duì)其適度修飾,希望在增加其穩(wěn)定性同時(shí),能保存或提高其抗氧化和抑制酪氨酸酶活性能力,無(wú)疑是一項(xiàng)很有意義的工作。根皮素異煙酰基腙的合成和相關(guān)活性研究便是基于這一思路進(jìn)行的。目前有關(guān)根皮素抗氧化和抑制酪氨酸酶活性的研究較多,但研究根皮素及其化學(xué)修飾物根皮素異煙�；觐A(yù)防和治療急性肝損傷和抗癌作用機(jī)制的工作未見(jiàn)報(bào)道,基于此,本論文從這一方面展開(kāi)了相關(guān)研究�；诒緦�(shí)驗(yàn)室的前期工作積累,本論文以槲皮素為參照物,研究了根皮素、根皮素異煙�；�(本實(shí)驗(yàn)室合成和結(jié)構(gòu)表征)的抗氧化和抑制酪氨酸酶活性;分別采用常用的D-氨基半乳糖、硫代乙酰胺和對(duì)乙酰氨基苯酚造模,研究了根皮素和根皮素異煙�；陮�(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。采用MTT法、流式細(xì)胞儀測(cè)定法、凝膠電泳法、蛋白印跡雜交和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法,初步探索了根皮素和根皮素異煙酰基腙調(diào)控人肝癌BEL-7402細(xì)胞增殖和凋亡作用機(jī)制。研究結(jié)果表明,就采用的抗氧化模型而言,根皮素和根皮素異煙�；昃哂辛己玫目寡趸钚�,而且根皮素異煙酰基腙活性明顯優(yōu)于根皮素,甚至優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照物槲皮素。而對(duì)于抑制酪氨酸酶二酚酶活性實(shí)驗(yàn)而言,根皮素活性?xún)?yōu)于根皮素異煙�；辍＞脱芯康母螕p傷模型而言,根皮素異煙�；昕寡趸螕p傷活性明顯優(yōu)于根皮素,甚至優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照物槲皮素。關(guān)于調(diào)控人肝癌bel-7402細(xì)胞增殖和凋亡作用機(jī)制實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,根皮素和根皮素異煙�；陮�(duì)bel-7402細(xì)胞具有細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。誘導(dǎo)bel-7402細(xì)胞凋亡的途徑,主要包括p53信號(hào)通路,bcl-2家族線(xiàn)粒體信號(hào)通路和由htert控制的端粒穩(wěn)定性。綜上所述,根皮素和根皮素異煙�；晔橇己玫目寡趸瘎┖屠野彼崦付用富钚砸种苿�,具有防治急性肝損傷的活性,對(duì)人肝癌bel-7402細(xì)胞具有細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用,是值得進(jìn)一步研究的防治急性肝損傷的新型候選藥物。第一章:緒論首先介紹了根皮素,酰腙化合物和酪氨酸酶的研究現(xiàn)狀。然后介紹了急性肝損傷的病因、損傷機(jī)理,天然藥物抗急性肝損傷的研究進(jìn)展。再介紹了人肝癌凋亡機(jī)理研究進(jìn)展,主要包括目前研究較多的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和中藥黃酮類(lèi)化合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展。第二章:研究了槲皮素、根皮素、根皮素異煙�；�、水飛薊賓抗氧化活性。研究方法包括清除dpph自由基、清除abts自由基,抑制體外肝臟線(xiàn)粒體脂質(zhì)過(guò)氧化活性,和抗氧化保護(hù)超螺旋pbr322質(zhì)粒dna。研究結(jié)果表明,根皮素異煙�；�、槲皮素、根皮素、水飛薊賓具有明顯的清除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化活性,呈濃度依賴(lài)性效應(yīng),活性順序依次為根皮素異煙�；觊纹に馗に厮w薊賓。根皮素異煙�；甑捏w系終濃度ic50分別為2.5μmol/l、2.27μmol/l、2.08μmol/l。槲皮素的體系終濃度ic50分別為4.0μmol/l、3.64μmol/l、6.67μmol/l。根皮素的體系終濃度ic50分別為10.0μmol/l、4.54μmol/l、12.50μmol/l。水飛薊賓的體系終濃度ic50分別為125.0μmol/l、7.10μmol/l、104.16μmol/l。研究表明,根皮素異煙�；辍㈤纹に睾透に乜梢詼p少aaph誘導(dǎo)的超螺旋pbr322質(zhì)粒dna破壞程度,而且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。抑制活性的排列順序?yàn)楦に禺悷燉；觊纹に馗に亍？傊?研究結(jié)果表明,就采用的抗氧化模型而言,根皮素和根皮素異煙�；昃哂辛己玫目寡趸钚�,其中根皮素異煙酰基腙活性?xún)?yōu)于根皮素,甚至優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照物槲皮素。第三章:研究了根皮素和根皮素異煙酰基腙抑制酪氨酸酶活性。以l-dopa為底物測(cè)定槲皮素、根皮素、根皮素異煙�；暌种评野彼崦付用富钚缘膇c50值,抑制的類(lèi)型,并測(cè)定相應(yīng)的抑制常數(shù)kI和kIS。試驗(yàn)結(jié)果顯示,槲皮素、根皮素、根皮素異煙�；暌种评野彼崦付用富盍Φ膇c50值分別為25μmol/l,37.5μmol/l和50μmol/L(n=5,P0.05)。活性順序?yàn)殚纹に馗に馗に禺悷燉；�。根皮素和根皮素異煙�；陮?duì)酶活力的抑制作用表現(xiàn)為可逆抑制作用,而且為混合型可逆抑制,根皮素KI為23.5μmol/L,KIS為129.0μmol/L,根皮素異煙酰基腙KI為57.5μmol/L,KIS為187.1μmol/L。研究結(jié)果表明,根皮素和根皮素異煙�；昃哂泻芎玫囊种评野彼崦付用富钚�,是混合型可逆抑制,而且根皮素活性?xún)?yōu)于根皮素異煙�；辍５谒恼�:研究了槲皮素、根皮素和根皮素異煙酰基腙對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。本試驗(yàn)分別采用D-氨基半乳糖、硫代乙酰胺和對(duì)乙酰氨基苯酚造模,誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷,再研究槲皮素、根皮素和根皮素異煙酰基腙對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用,通過(guò)血清學(xué)(ALT、AST、γ-GT、ALP和血清總膽紅素)、組織學(xué)方法,研究藥物對(duì)肝臟的生化反應(yīng)和組織病理變化的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,藥物處理組小鼠血清ALT、AST、γ-GT、ALP和血清總膽紅素明顯降低(P0.05),而且降低幅度呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。活性順序?yàn)楦に禺悷燉；觊纹に馗に亍ｎA(yù)處理了根皮素、槲皮素和根皮素異煙�；甑男∈蟾谓M織病理學(xué)病變,得到了明顯改善。研究結(jié)果表明,槲皮素、根皮素和根皮素異煙酰基腙對(duì)小鼠急性肝損傷有顯著的保護(hù)作用,而且根皮素異煙�；昊钚悦黠@優(yōu)于根皮素,甚至優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照物槲皮素。第五章:探索了根皮素和根皮素異煙�；暾T導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理。本研究通過(guò)MTT法、流式細(xì)胞儀測(cè)定法、凝膠電泳法、蛋白印跡雜交和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法,探索根皮素和根皮素異煙�；暾T導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制�？偨Y(jié)機(jī)理,主要包括:抑制細(xì)胞增殖;作用于細(xì)胞周期的G0/G1期,阻滯細(xì)胞增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡;降解基因組DNA;減少hTERT、p53和Bcl-2蛋白的表達(dá)量,增加Bax蛋白的表達(dá)量,減少hTERT基因的mRNA的表達(dá)量。結(jié)果表明,根皮素和根皮素異煙�；陮�(duì)BEL-7402細(xì)胞能產(chǎn)生細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。參與BEL-7402細(xì)胞凋亡的途徑,包括內(nèi)在和外在的凋亡途徑,即p53的信號(hào)通路,Bcl-2家族線(xiàn)粒體信號(hào)通路和由hTERT控制的端粒穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了根皮素和根皮素異煙�；暾T導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的部分分子機(jī)制,為根皮素和根皮素異煙酰基腙用作人類(lèi)肝癌預(yù)防和化療藥物,奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：根皮素 根皮素異煙酰基腙 抗氧化活性 抑制酪氨酸酶活性 急性肝損傷 D-氨基半乳糖 硫代乙酰胺 對(duì)乙酰氨基苯酚 凋亡機(jī)理 人肝癌細(xì)胞 蛋白印跡雜交 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R575
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-12
• 縮寫(xiě)符號(hào)12-14
• 第一章 緒論14-37
• 1.1 根皮素研究概述14-15
• 1.2 酰腙類(lèi)化合物研究概述15-16
• 1.3 酪氨酸酶研究概述16-17
• 1.4 急性肝損傷研究進(jìn)展17-23
• 1.4.1 急性肝損傷的病因和損傷機(jī)理17-20
• 1.4.2 急性肝損傷的流行病學(xué)20
• 1.4.3 天然化合物抗急性肝損傷的研究進(jìn)展20-23
• 1.5 人肝癌凋亡機(jī)理研究概述23-28
• 1.5.1 目前研究較多的各種肝癌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路23-27
• 1.5.2 人肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)理研究常見(jiàn)的幾種測(cè)定靶標(biāo)27-28
• 1.6 課題來(lái)源28
• 1.7 主要研究?jī)?nèi)容和創(chuàng)新點(diǎn)28-29
• 1.8 參考文獻(xiàn)29-37
• 第二章 根皮素和根皮素異煙�；昕寡趸钚匝芯�37-51
• 2.1 引言37-38
• 2.2 材料與方法38-41
• 2.3 結(jié)果與討論41-47
• 2.3.1 根皮素異煙酰基腙的表征41-42
• 2.3.2 清除DPPH自由基試驗(yàn)42-44
• 2.3.3 清除ABTS自由基試驗(yàn)44
• 2.3.4 抑制體外肝臟線(xiàn)粒體脂質(zhì)過(guò)氧化試驗(yàn)44-45
• 2.3.5 抗氧化保護(hù)超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA試驗(yàn)45-47
• 2.4 結(jié)論47-48
• 2.5 參考文獻(xiàn)48-51
• 第三章 根皮素和根皮素異煙�；暌种评野彼崦富钚匝芯�51-59
• 3.1 引言51
• 3.2 材料與方法51-53
• 3.3 結(jié)果與討論53-57
• 3.3.1 化合物對(duì)酪氨酸酶二酚酶活力的影響53
• 3.3.2 化合物對(duì)酪氨酸酶活力的抑制作用機(jī)理53-54
• 3.3.3 化合物抑制酪氨酸酶活性類(lèi)型和抑制常數(shù)的測(cè)定54-57
• 3.4 結(jié)論57
• 3.5 參考文獻(xiàn)57-59
• 第四章 根皮素和根皮素異煙�；攴乐渭毙愿螕p傷研究59-77
• 4.1 引言59-60
• 4.2 材料與方法60-62
• 4.3 結(jié)果與討論62-74
• 4.3.1 藥物對(duì)ALT、AST活性的影響62-63
• 4.3.2 藥物對(duì) γ-GT和ALP活性的影響63-64
• 4.3.3 藥物對(duì)血清總膽紅素含量的影響64-65
• 4.3.4 組織病理學(xué)觀察65-74
• 4.4 結(jié)論74-75
• 4.5 參考文獻(xiàn)75-77
• 第五章 根皮素和根皮素異煙酰基腙誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)理研究77-95
• 5.1 引言77
• 5.2 材料與方法77-81
• 5.3 結(jié)果與討論81-90
• 5.3.1 MTT法測(cè)定藥物處理對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響81-82
• 5.3.2 流式細(xì)胞儀分析藥物處理對(duì)細(xì)胞周期的影響82-84
• 5.3.3 流式細(xì)胞儀分析藥物處理對(duì)熒光FITC標(biāo)記的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響84-85
• 5.3.4 凝膠電泳法檢測(cè)藥物處理對(duì)細(xì)胞的基因組DNA的影響85-87
• 5.3.5 檢測(cè)藥物處理組Bcl-2，，hTERT基因產(chǎn)物表達(dá)量和p53、Bax抑癌基因產(chǎn)物表達(dá)量變化87-89
• 5.3.6 檢測(cè)藥物處理對(duì)hTERT基因mRNA表達(dá)的影響89-90
• 5.4 結(jié)論90-92
• 5.5 參考文獻(xiàn)92-95
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果95-96
• 致謝96

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7 李翠蘋(píng);余燕影;曹樹(shù)穩(wěn);;根皮素乙酰阿魏酸酯的合成及抗氧化活性研究[J];天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā);2012年03期

8 孫s

本文編號(hào)：1103541