發(fā)布時間：2017-10-26 19:24

  本文關(guān)鍵詞：Nrf2過表達與敲減Hep1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的建立

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【摘要】：核因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)是治療非酒精性脂肪肝(NAFLD)的一個重要靶點分子。為了從體外研究小分子通過靶向Nrf2改善NAFLD的分子機制,首先PCR克隆鼠源Nrf2基因至p Lenti6/V5-D-TOPO溲空載體得到重組載體p Lenti6/V5-Nrf2,通過測序、酶切鑒定正確后,擴繁質(zhì)粒,制備慢病毒并將其感染Hep1-6肝癌細胞,用稻瘟醇胚素篩選、鑒定獲得穩(wěn)定表達Nrf2的細胞株。同時,用Nrf2干擾質(zhì)粒構(gòu)建慢病毒感染Hep1-6肝癌細胞,通過嘌呤霉素篩選、鑒定Nrf2敲減的細胞株。Q-PCR檢測結(jié)果顯示,過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株(p Lenti6/V5-Nrf2)中Nrf2基因的表達量為對照組(p Lenti6/V5-Lac Z)的4倍,敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)株中Nrf2基因的表達量大幅度降低。Western blotting顯示過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株的Nrf2表達量明顯高于對照組,敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)株的Nrf2表達量明顯低于對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株,此結(jié)果與Q-PCR結(jié)果一致。所克隆的Nrf2基因和敲減基因在Hep1-6小鼠肝癌細胞中得到了正確轉(zhuǎn)錄和翻譯,穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建成功。
【作者單位】： 南京大學生命科學院醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室;
【關(guān)鍵詞】： 核因子NF-E相關(guān)因子(Nrf) Hep-細胞 Nrf過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株 Nrf敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)株 Westernblotting 定量PCR
【分類號】：Q786
【正文快照】： blotting;定量PCR非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一類無過量飲酒史由其他多種誘因引起的臨床病理綜合征,它的主要特征為肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)蓄積,按病程進展可分為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化3種類型。關(guān)于非酒精性脂肪肝的發(fā)病機制,大家普遍認可的是“二次打擊”[，

本文編號：1100106