發(fā)布時(shí)間：2017-10-20 06:41

  本文關(guān)鍵詞：C.sinensis與HBV相互作用及EBOV的DNA疫苗免疫保護(hù)作用研究

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【摘要】：I.華支睪吸蟲(chóng)與乙型肝炎病毒感染的相互作用華支睪吸蟲(chóng)病(Clonorchiasis)是由華支睪吸蟲(chóng)(Clonorchis sinensis,C.sinensis)寄生于人體肝膽管內(nèi)所引起的人獸共患病,是我國(guó)重要的食源性寄生蟲(chóng)病,人因食入含有華支睪吸蟲(chóng)活囊蚴而感染,全球約有3500萬(wàn)人感染華支睪吸蟲(chóng),其中約1249萬(wàn)人分布在中國(guó)。華支睪吸蟲(chóng)的感染可導(dǎo)致膽囊炎、膽管炎、肝纖維化甚至肝膽管癌和原發(fā)性肝細(xì)胞癌,相關(guān)的研究顯示華支睪吸蟲(chóng)是原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生過(guò)程中不可忽略的誘發(fā)因素之一。乙型肝炎病毒感染呈全球性分布,是世界范圍內(nèi)重要的公共健康問(wèn)題,盡管現(xiàn)在乙肝疫苗較為普及,全球約有3.5億人是乙肝病毒攜帶者,其中我國(guó)近1億人為無(wú)癥狀表面抗原攜帶者,人在感染乙肝病毒后,30%-50%發(fā)展成為慢性乙肝,進(jìn)而發(fā)展成肝硬化,甚至肝癌。這兩種疾病都會(huì)對(duì)肝臟造成損傷,最終有可能發(fā)展成肝細(xì)胞癌。相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查顯示在華支睪吸蟲(chóng)病高度流行區(qū)域的HBs Ag表面抗原陽(yáng)性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于華支睪吸蟲(chóng)病非流行區(qū)域,但是目前關(guān)于華支睪吸蟲(chóng)感染與乙型肝炎病毒感染的相互關(guān)系尚不明確。因此本研究首先分析合并華支睪吸蟲(chóng)與乙肝病毒感染患者與單純乙肝病毒感染患者及單純?nèi)A支睪吸蟲(chóng)病感染患者在肝臟受損程度上是否在差異,并分析合并華支睪吸蟲(chóng)感染對(duì)乙肝患者抗病毒治療的影響,以及初步探討華支睪吸蟲(chóng)合并乙型病毒感染致肝臟損傷的原因。研究目的華支睪吸蟲(chóng)感染合并乙型肝炎病毒感染致肝臟損傷原因的初步探討研究方法與結(jié)果1.病例選擇的標(biāo)準(zhǔn)首先通過(guò)對(duì)2014年7月至2015年2月期間于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院就診的門(mén)診及住院患者的病例按照以下3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)納入單純乙肝患者病例組:1)年齡:滿18周歲,男女不限;2)血清學(xué)HBs Ag陽(yáng)性;3)血清學(xué)HBV DNA拷貝數(shù)≥20IU/ml;在以上3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,在糞檢中檢出華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵的患者納入合并華支睪吸蟲(chóng)與乙肝病毒感染患者病例組;并且,以在糞檢中檢出華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵及血清學(xué)HBs Ag陰性患者為單純?nèi)A支睪吸蟲(chóng)患者組;同時(shí),以未在糞檢中檢出華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵及血清學(xué)HBs Ag陰性的正常人作為對(duì)照組;除此以外,按照以下四項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)排除其余病例:1)合并HIV、HAV、HCV、HDV等其他肝炎病毒感染患者;2)酒精肝性患者;3)自身免疫性疾病患者;4)合并其他蠕蟲(chóng)及原蟲(chóng)感染患者;5)一、二型糖尿病患者;6)妊娠或者哺乳期女性。2.合并感染患者與單純乙肝患者的肝功能的比較由于兩種疾病都最終作用于肝臟,因此通過(guò)比較肝功能來(lái)分析合并華支睪吸蟲(chóng)感染對(duì)乙肝患者的影響。評(píng)價(jià)肝功能主要觀察指標(biāo)為血清學(xué)為谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT),谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和總膽紅素(TB)(其中ALT和AST均采用賴氏法,正常值分別為3-35U/L和15-40U/L,TB正常值為4.0-23.9umol/L),ALT和AST2倍正常上限值,TB3倍正常上限值視為肝功能損害。同時(shí)比較血清中HBV DNA的含量差異(正常值為陰性)。根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)一共有701例病人被納入分析,其中520例病人為單純乙肝患者,51例病人為合并感染患者,53例病例為單穿華支睪吸蟲(chóng)感染患者,并且隨機(jī)選取77例正常人作為對(duì)照組。其中男性合并感染患者的人數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于女性感染患者。合并感染患者血清中ALT,AST,TB和HBV DNA水平明顯高于單純乙肝患者以及單純?nèi)A支睪吸蟲(chóng)感染患者組,提示合并感染患者的肝功能損傷嚴(yán)重及合并華支睪吸蟲(chóng)感染會(huì)加劇病程的發(fā)展。3.華支睪吸蟲(chóng)感染度與HBV DNA拷貝數(shù)的關(guān)系華支睪吸蟲(chóng)感染程度由糞檢中檢測(cè)到蟲(chóng)卵數(shù)所決定,而合并感染患者呈現(xiàn)高HBV DNA拷貝數(shù),進(jìn)一步分析華支睪吸蟲(chóng)感染程度是否與HBV DNA復(fù)制量有關(guān)系。本研究所收集到的合并感染患者都是輕度感染華支睪吸蟲(chóng),在輕度感染時(shí),HBV DNA的復(fù)制量并沒(méi)有隨蟲(chóng)卵數(shù)的增加而增加;然而HBV DNA復(fù)制量小于106次方時(shí)在糞檢中蟲(chóng)卵的數(shù)量要明顯高于復(fù)制量大于106次方時(shí),說(shuō)明HBV DNA高復(fù)制量有可能會(huì)抑制蟲(chóng)卵從機(jī)體中排出。4.合并華支睪吸蟲(chóng)感染對(duì)抗病毒治療的影響選取合并感染患者,按照接受恩替卡韋(ETV)抗病毒治療的基礎(chǔ)上是否接受吡喹酮(PZQ)驅(qū)蟲(chóng)治療分為聯(lián)合治療和單純抗病毒治療組,比較兩組病人在接受一個(gè)療程的治療后的肝功能相關(guān)指標(biāo)以及HBV DNA水平。結(jié)果顯示合并感染患者在接受一個(gè)療程的治療后,接受驅(qū)蟲(chóng)和抗病毒聯(lián)合治療的合并感染患者的TB和HBV DNA水平明顯低于單一抗病毒治療組,然而ALT與AST水平在兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示合并華支睪吸蟲(chóng)感染可能會(huì)減弱抗病毒治療的療效。5.華支睪吸蟲(chóng)ESP對(duì)乙肝病毒復(fù)制的影響用含有2x106 HBV DNA的乙肝患者血清與華支睪吸蟲(chóng)ESP(20ug/ml)共同孵育感染正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞,以乙肝患者血清單獨(dú)感染為對(duì)照組,感染48小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA拷貝數(shù)。結(jié)果顯示培養(yǎng)48小時(shí)后,混合感染組的HBV DNA拷貝數(shù)明顯高于單純乙肝患者血清組,提示ESP有可能會(huì)增強(qiáng)乙肝病毒在外周血單個(gè)核細(xì)胞中的復(fù)制。6.華支睪吸蟲(chóng)ESP對(duì)宿主細(xì)胞因子表達(dá)的影響用華支睪吸蟲(chóng)ESP與乙肝患者血清共同孵育感染外周血單個(gè)核細(xì)胞,培養(yǎng)48小時(shí)后Real Time PCR法和ELISA法分別檢測(cè)細(xì)胞中和細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的表達(dá),以正常培養(yǎng)的細(xì)胞做對(duì)照組。Real-Time PCR結(jié)果顯示單純乙肝患者血清實(shí)驗(yàn)組和單獨(dú)華支睪吸蟲(chóng)ESP實(shí)驗(yàn)組都能誘導(dǎo)PBMC表達(dá)Th1型和Th2型細(xì)胞因子,ESP實(shí)驗(yàn)組以Th2型細(xì)胞因子為主;并且相對(duì)單純乙肝患者血清實(shí)驗(yàn)組而言,ESP與乙肝患者血清混合物實(shí)驗(yàn)組的Th2型細(xì)胞因子包括IL-4,IL-6和IL-10水平明顯增高,然而在Th1型細(xì)胞因子包括IL-2和IFN-γ在兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ELISA結(jié)果顯示與乙肝患者血清刺激PBMC相比,用ESP與乙肝患者血清混合刺激PBMC分泌的IFN-γ水平明顯降低,但是IL-4,IL-6和IL-10的表達(dá)水平是明顯增高,上述結(jié)果提示華支睪吸蟲(chóng)ESP存在的前提下,細(xì)胞因子的表達(dá)可能由Th1型轉(zhuǎn)向Th2型,提示合并華支睪吸蟲(chóng)感染時(shí)會(huì)加劇機(jī)體Th1/Th2細(xì)胞因子失衡的狀態(tài)。7.感染患者血清學(xué)中細(xì)胞因子表達(dá)的變化收集合并感染患者、乙肝患者和華支睪吸蟲(chóng)患者接受治療前的血清,分析相關(guān)細(xì)胞因子在三者血清學(xué)上的表達(dá)變化,以正常健康人作為對(duì)照組。結(jié)果顯示,華支睪吸蟲(chóng)感染患者血清學(xué)中主要以Th2型細(xì)胞因子為主,而乙肝患者的IFN-γ在合并感染患者中的表達(dá)水平都要比乙肝患者和華支睪吸蟲(chóng)感染患者低,而細(xì)胞因子IL-2和IL-4在合并感染患者中要比乙型肝炎患者低,但并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而IL-10和IL-6在合并感染患者中的表達(dá)水平要比乙肝患者要明顯增高,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8.研究結(jié)論在乙肝病毒感染時(shí)合并華支睪吸蟲(chóng)感染會(huì)加劇肝臟損傷進(jìn)而影響肝功能,而且會(huì)削弱抗病毒治療療效;華支睪吸蟲(chóng)的ESP有助于乙肝病毒的復(fù)制;合并華支睪吸蟲(chóng)與乙肝病毒感染時(shí)會(huì)加劇機(jī)體Th1/Th2細(xì)胞因子失衡,并且可能以Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答為主從而影響病毒的清除。II.EBOV的DNA疫苗免疫保護(hù)作用研究埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)是單股負(fù)鏈RNA病毒,與馬爾堡病毒同屬絲狀病毒科,該病毒是埃博拉出血熱(Ebola hemorrhagic fever,EHF)的病原體,能引起人類和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的一種急性出血性傳染病,感染后死亡率高達(dá)90%。EBOV于1967年被首次發(fā)現(xiàn),目前全世界仍然缺乏有效的治療性或者預(yù)防性EBOV疫苗,其被列為生物安全等級(jí)四級(jí)(BSL-4)病毒,具有作為生化武器的潛力。目前,我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)該病,但隨著世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,EBOV也有傳入我國(guó)的潛在危險(xiǎn),因此,對(duì)EBOV疫苗的相關(guān)研究具有重大的意義。EBOV含有7個(gè)基因,其基因組能編碼8種蛋白;其中EBOV的第四個(gè)基因GP基因具有兩個(gè)閱讀編碼框,未經(jīng)m RNA編輯的GP基因主要編碼s GP蛋白,含量約為80%;由于m RNA的編輯作用編碼產(chǎn)生GP蛋白(Glycoprotein,GP),GP糖蛋白是由于在m RNA編輯位點(diǎn)處插入一個(gè)腺苷殘基,從而導(dǎo)致編碼框移從而產(chǎn)生GP糖蛋白,含量約為20%。大量的研究表明作為埃博拉病毒表面唯一的跨膜蛋白GP是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的主要蛋白,然而關(guān)于s GP在病毒感染過(guò)程中的具體功能還未有詳細(xì)的研究。關(guān)于其他病毒的分泌性糖蛋白s GP的相關(guān)研究表明其有可能結(jié)合特異性中和抗體從而逃避宿主的免疫攻擊以及干擾抗體介導(dǎo)的病毒清除,然而還未有足夠的研究關(guān)于EBOV的分泌性糖蛋白s GP的相關(guān)功能。研究目的探討埃博拉病毒分泌型s GP蛋白在病毒感染中的相關(guān)機(jī)制方法和結(jié)論1.埃博拉病毒GP基因編輯位點(diǎn)點(diǎn)突變免疫原性分析通過(guò)利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)扎伊爾型埃博拉病毒的GP基因的m RNA編輯位點(diǎn)7個(gè)連續(xù)的腺苷后插入一個(gè)腺苷從而獲得連續(xù)8個(gè)腺苷獲得GP-8A,主要表達(dá)GP1,2;為了消除轉(zhuǎn)錄過(guò)程中由于聚合酶的滑移作用的影響,在7個(gè)連續(xù)腺苷處進(jìn)行了沉默點(diǎn)突變由A突變?yōu)镚獲得s GP1,2 Edit,其完全表達(dá)s GP蛋白;同樣在GP-8A基因的基礎(chǔ)上也進(jìn)行沉默點(diǎn)突變由A變?yōu)镚獲得GP1,2Edit完全表達(dá)GP1,2蛋白;再將上述基因克隆至真核p CAGGs載體并測(cè)序鑒定。隨后,我們將真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,24小時(shí)后收集上清和細(xì)胞,利用Western blot方法檢測(cè)到s GP蛋白和GP蛋白的表達(dá),結(jié)果表明在編輯位點(diǎn)處進(jìn)行點(diǎn)突變有助于蛋白表達(dá)的增加。隨后,我們用上述獲得的真核表達(dá)質(zhì)粒以肌肉注射的途徑免疫小鼠,收集免疫后小鼠血清,利用ELISA檢測(cè)血清中特異性抗體的滴度,結(jié)果顯示s GP Edit和GP-7A誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性s GP抗體水平要明顯高于EBO-GP1.2 Edit和GP-8A,而EBO-GP1.2 Edit和GP-8A誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性GP抗體水平要明顯高于s GP Edit和GP-7A。2.s GP可以與GP蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合由s GP免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的GP抗體由于s GP和GP1.2都可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生s GP抗體和GP抗體,我們利用western blot技術(shù)進(jìn)一步分析GP1.2和s GP誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體所針對(duì)的抗原表位是否一致,結(jié)果顯示s GP免疫血清識(shí)別s GP蛋白的能力要明顯強(qiáng)于GP蛋白,而GP免疫血清識(shí)別GP蛋白的能力要明顯強(qiáng)于s GP蛋白,表明GP1.2誘導(dǎo)產(chǎn)生的GP抗體所針對(duì)抗原表位并不存在于s GP上。接著我們利用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法檢測(cè)s GP蛋白與GP蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GP抗體的能力,結(jié)果顯示s GP蛋白能夠與GP蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合s GP免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的GP抗體,然而不能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GP免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的GP抗體,提示GP免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的GP抗體所針對(duì)的抗原表位只特定存在于GP蛋白上,而s GP免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的GP抗體所針對(duì)的抗原表位是s GP與GP共享的抗原表位。3.抗體中和能力分析中和抗體是抗病毒免疫和評(píng)價(jià)疫苗免疫治療效果的重要檢測(cè)指標(biāo)之一,我們利用假病毒中和實(shí)驗(yàn)體系檢測(cè)s GP和GP誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的區(qū)別,首先我們用p SG3?env質(zhì)粒與埃博拉病毒膜蛋白的GP質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝形成埃博拉假病毒,然后用不同稀釋倍數(shù)的免疫組血清與500pfu/ml的假病毒共同孵育1小時(shí)后感染TZM-bl細(xì)胞,48小時(shí)通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的表達(dá),結(jié)果顯示s GP和GP誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體均具有中和假病毒的能力,而且GP免疫組所產(chǎn)生的中和抗體活性高于s GP免疫組。接著,我們通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性中和實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)s GP蛋白干擾抗體中和病毒的能力,結(jié)果顯示s GP蛋白能夠完全減弱s GP Edit免疫組抗體中和假病毒的活性,并且這種能力隨著s GP蛋白濃度的增加而增強(qiáng);然而,s GP蛋白干擾抗體的中和活性并沒(méi)有在GP Edit免疫組有所體現(xiàn)。4.小鼠的免疫及攻毒實(shí)驗(yàn)為了探討s GP和GP1,2在保護(hù)小鼠抵抗致死劑量埃博拉病毒攻擊感染上是否存在差異,我們用s GP和GP1,2以肌肉注射的途徑免疫小鼠,初免4周后以同樣的劑量及方式行加強(qiáng)免疫一次,加強(qiáng)免疫四周后,其中兩組予以交叉免疫即s GP免疫組予以GP加強(qiáng)免疫,而GP免疫組予以s GP交叉免疫,另兩組分別予以相同的抗原再次加強(qiáng)免疫一次,還有兩組不再加強(qiáng)免疫。免疫12周后小鼠經(jīng)腹腔注射含有1000pfu的同源鼠適應(yīng)埃博拉病毒進(jìn)行攻毒。首先檢測(cè)免疫后抗體滴度的變化,ELISA結(jié)果顯示3次GP免疫后均可提高GP抗體產(chǎn)生水平且明顯高于GP-s GP交叉免疫組,3次s GP免疫后均可提高s GP抗體產(chǎn)生水平且明顯高于s GP-GP交叉免疫組,并且在兩組交叉免疫組能明顯增加s GP抗體水平。接著,中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2次同源免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體均具有中和假病毒的活性,3次s GP和3次GP免疫組的抗體中和活性有明顯增加,但是交叉免疫組的抗體中和活性并沒(méi)有增加。最后,攻毒實(shí)驗(yàn)顯示2次s GP免疫組只有1只老鼠存活,3只小鼠和1只小鼠分別在攻毒第5天和第8天死亡,其余免疫組除對(duì)照組外均存活;然而,只有在3次GP免疫組和GP-s GP免疫組的小鼠仍保持健康狀態(tài)外其余免疫組小鼠伴有10-15%的體重下降以及疾病狀態(tài)。5.研究結(jié)論在GP基因的m RNA編輯位點(diǎn)處獲得GP1.2和s GP,進(jìn)行點(diǎn)突變可明顯增加s GP和GP蛋白的表達(dá)水平,并且s GP和GP分別誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性GP和s GP抗體水平,并且s GP和GP誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體具有中和假病毒的活性,高水平的特異性GP抗體是保護(hù)小鼠抵抗致死劑量埃博拉病毒攻擊的關(guān)鍵。
【關(guān)鍵詞】：華支睪吸蟲(chóng) 乙型肝炎病毒 Th1/Th2型 細(xì)胞因子 埃博拉病毒 GP糖蛋白 分泌性糖蛋白 攻擊感染
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.62;R532.23
【目錄】：

• 中文摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 第一部分 C.SINENSIS與HBV的相互作用20-48
• 前言20-23
• 第一章 華支睪吸蟲(chóng)合并乙型肝炎病毒感染臨床數(shù)據(jù)分析23-33
• 1 引言23
• 2 材料和方法23-25
• 3 結(jié)果25-31
• 4 討論31-32
• 5 小結(jié)32-33
• 第二章 華支睪吸蟲(chóng)合并乙型感染病毒感染對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的影響33-48
• 1 引言33
• 2 材料與方法33-38
• 3 結(jié)果38-44
• 4 討論44-46
• 5 小結(jié)46-48
• 第二部分 EBOV的DNA疫苗免疫保護(hù)作用研究48-87
• 前言48-51
• 第三章 EBOV-SGP和EBOV-GP1,2 基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與生物功能的初步分析51-75
• 1 引言51
• 2 材料51-54
• 3 實(shí)驗(yàn)方法54-62
• 4 結(jié)果62-73
• 5 討論73-75
• 6 小結(jié)75
• 第四章 GP和SGP對(duì)小鼠免疫保護(hù)效力的研究75-87
• 1 引言75-76
• 2 材料76
• 3 方法76-78
• 4 結(jié)果78-84
• 5 討論84-86
• 6 小結(jié)86-87
• 總結(jié)87-88
• 參考文獻(xiàn)88-96
• 附錄一 在讀期間發(fā)表論文情況96-97
• 附錄二 主要英文詞匯表97-99
• 致謝99

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本文編號(hào)：1065825