本文關(guān)鍵詞：腸結(jié)核與克羅恩病腸粘膜組織中膠原纖維及相關(guān)蛋白表達研究

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【摘要】：研究背景腸結(jié)核(intestinal tuberculosis，ITB)是由結(jié)核分支桿菌感染引起的腸道特異性感染性疾病,是最常見的肺外結(jié)核之一,主要因感染人型結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起,少數(shù)因進食未經(jīng)消毒的乳制品或牛奶而感染牛型結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium bovis)引起；克羅恩病(crohn's disease,CD)是一種病因尚未明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,其發(fā)生可能是遺傳與環(huán)境共同作用的結(jié)果,可以累及從口腔至肛門整個消化道任何部位。腸結(jié)核與克羅恩病是兩種病因完全不同的疾病,但均可導(dǎo)致腸道慢性肉芽腫性改變,兩病在臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡特點,組織病理學(xué)特征等方面十分相似,缺乏特異性診斷指標(biāo),臨床上鑒別困難,有報道兩者相互誤診率達50-70%。由于病因、治療方案及預(yù)后截然不同,當(dāng)兩病發(fā)生誤診時將會導(dǎo)致嚴(yán)重后果。當(dāng)腸結(jié)核被誤診為克羅恩病時使用免疫抑制劑治療將引起結(jié)核擴散,甚至危及患者生命；而當(dāng)克羅恩病被誤診為腸結(jié)核時使患者承受不必要的抗結(jié)核治療藥物的毒副作用,同時延誤原發(fā)病的治療可能引起原可以避免的并發(fā)癥發(fā)生。因此,準(zhǔn)確鑒別腸結(jié)核與克羅恩病十分必要。正常情況下,組織損傷后有再生和纖維性修復(fù)兩種方式,兩種過程保持動態(tài)平衡,維持著腸道正常的結(jié)構(gòu)和功能。腸結(jié)核與克羅恩病均引起腸道長期慢性炎癥,目前推測,腸道長期慢性炎癥刺激導(dǎo)致腸道組織損傷,釋放大量炎性介質(zhì),刺激成纖維細(xì)胞等活化并在損傷部位聚集,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成增多,降解減少,過量細(xì)胞外基質(zhì)的沉積可導(dǎo)致腸道纖維化的形成。因此,腸道纖維化在腸結(jié)核與克羅恩病中均起著重要作用。在眾多參與纖維化形成的蛋白中,轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)是目前公認(rèn)的最重要的致纖維化細(xì)胞因子,在腸道纖維化過程中起重要作用。在克羅恩病狹窄腸段中TGF-β表達明顯增高,并與成人克羅恩病引起早期腸道切除術(shù)相關(guān)。目前有不少研究探討克羅恩病中腸道纖維化形成的機制。相關(guān)研究提示克羅恩病相關(guān)的腸道纖維化可能與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關(guān),表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達減少,間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(如波形蛋白,vimentin)表達增加。纖維沉積在不同疾病中表現(xiàn)出不同的特征,如在克羅恩病中,纖維沉積可累及腸道全層,進而引起腸腔狹窄,而在潰瘍性結(jié)腸炎中,纖維沉積一般局限在粘膜層及粘膜下層,很少導(dǎo)致腸腔狹窄。不同疾病纖維沉積的差異提示不同病因引起的腸道纖維化在程度及機制上也可能存在差異,比較不同病因所致的腸道纖維化程度及纖維化相關(guān)蛋白表達差異可能為鑒別不同疾病提供線索。因此,本研究擬通過比較腸結(jié)核與克羅恩病腸鏡活檢粘膜組織中總膠原纖維、Ⅰ型、Ⅲ型膠原沉積量及纖維化相關(guān)蛋白TGF-β、vimentin表達差異,探索這些指標(biāo)在鑒別腸結(jié)核與克羅恩病中的價值,尋找鑒別兩病的新方法。目的通過分析腸結(jié)核與克羅恩病患者腸鏡活檢標(biāo)本膠原纖維及纖維化相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、波形蛋白(vimentin)在兩者間表達水平差異,探索其在鑒別兩病中的價值,尋找鑒別兩種疾病的新方法。方法收集2006年1月至2015年6月在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院確診為腸結(jié)核、克羅恩病患者的腸鏡活檢標(biāo)本,同時收集健康體檢者的回盲部組織作為正常對照組,其中腸結(jié)核組15例,克羅恩病組19例,正常對照組15例。每例病理組織連續(xù)切片4張,分別行masson染色、免疫熒光雙染色、免疫組化染色。采用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)分析圖片,計算累積吸光度(Integral optical density,IOD),以IOD反應(yīng)各指標(biāo)表達水平,比較各指標(biāo)在三組間表達差異,并采用受試者工作曲線(Receiver Operator Curve,ROC曲線)評價這些指標(biāo)對鑒別兩病的價值。所得數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件分析,P小于0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果腸結(jié)核組、克羅恩病組臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡下及病理學(xué)特征比較腸結(jié)核組與克羅恩病組臨床表現(xiàn)及并發(fā)癥比較：在臨床表現(xiàn)方面,腹痛、腹瀉、體重下降在克羅恩病組較腸結(jié)核組多見,而發(fā)熱、血便在腸結(jié)核組較克羅恩病組多見,但這些癥狀在兩組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均0.05)；腸結(jié)核組合并腸外結(jié)核較克羅恩病組多,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028),克羅恩病組合并腸腔狹窄、腸梗阻、瘺管形成均較腸結(jié)核多,但兩者比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均0.05)。腸結(jié)核組與克羅恩病組內(nèi)鏡下表現(xiàn)及病理組織學(xué)特征比較：在內(nèi)鏡下表現(xiàn)方面,假性息肉及鵝卵石征在克羅恩病中更常見,顯著高于腸結(jié)核組(P0.05),腸粘膜充血、糜爛、潰瘍形成、縱行潰瘍及粘膜橋形成在克羅恩病組中較腸結(jié)核組中多見,而回盲瓣受累、環(huán)形潰瘍在腸結(jié)核組中較克羅恩病組中更常見,但這些指標(biāo)在兩病間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均0.05)。在組織病理學(xué)特征方面,干酪樣肉芽腫在腸結(jié)核組中發(fā)生率顯著高于克羅恩病組,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；而腸粘膜慢性炎、肉芽腫形成、非干酪樣肉芽腫、裂隙狀潰瘍在兩者中比較無顯著性差異(P值均0.05)。Masson染色檢測總膠原纖維在各組間表達通過masson染色法觀察膠原纖維在各組間表達,在Masson染色中,膠原纖維呈藍色信號。正常腸道組織中可觀察到少量膠原纖維均勻分布于腸道各層中,腸結(jié)核組及克羅恩病組膠原纖維表達顯著增高,交錯排列于腸道各層中。各組間膠原纖維含量比較：(1)三組間總膠原纖維含量(正常組：6964.20±819.98；腸結(jié)核組：22093.53±1643.12；克羅恩病組：15200.42±1232.63)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；(2)組間比較：a.在腸結(jié)核組與克羅恩病組中,纖維沉積量顯著增高,總膠原纖維定量均顯著高于正常對照組(P正常組VSITB組=0.000；PCD組vs正常組=0.000)；b.腸結(jié)核組與克羅恩病組比較,腸結(jié)核組總膠原沉積量顯著高于克羅恩病組(P=0.007)；表明腸結(jié)核與克羅恩病均可引起腸道不同程度纖維沉積,且以腸結(jié)核引起腸道纖維沉積更顯著。免疫熒光雙染法檢測Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維在各組間表達通過免疫熒光雙染法觀察Ⅰ型、Ⅲ型膠原在三組間表達,免疫熒光雙染中,紅色熒光為Ⅰ型膠原沉積信號,呈紅色粗顆粒狀；綠色熒光為Ⅲ型膠原沉積信號,呈綠色網(wǎng)狀排列。各組間Ⅰ型膠原沉積量比較：(1)三組間Ⅰ型膠原沉積量(正常組3475.60±397.32;腸結(jié)核組：7086.13±948.45;克羅恩病組：4304.47±454.17)比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；(2)組間比較：a.Ⅰ型膠原纖維沉積量在腸結(jié)核組顯著高于正常組及克羅恩病組(PCD組VSITB組=0.045；PITB組VS正常組=0.007)；b.克羅恩病組Ⅰ型膠原沉積量與正常對照組比較無顯著性差異(P=0.440)。各組間Ⅲ型膠原沉積量比較：(1)三組間Ⅲ型膠原沉積量(正常組2684.80±328.82；腸結(jié)核組：17030.47±1697.28；克羅恩病組：11292.11±758.46)比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)組間比較：a.腸結(jié)核組與克羅恩病組Ⅲ型膠原纖維沉積量均顯著高于正常對照組(PCD組vs正常組=0.000,PITB組VS正常組=0.000)；b.與克羅恩病組比較,腸結(jié)核組Ⅲ型膠原纖維沉積量顯著增高(P=0.017)。表明腸結(jié)核與克羅恩病引起纖維沉積中纖維亞型存在一定差異,腸結(jié)核可引起Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維在腸道沉積顯著增多,而克羅恩病引起膠原纖維沉積以Ⅲ型膠原纖維為主,且腸結(jié)核組Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維沉積均顯著高于克羅恩病組。免疫組化檢測TGF-β、 vimentin在各組間表達光鏡下可見轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)、波形蛋白(vimentin)陽性信號呈棕黃色顆粒,TGF-β在腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞中均有表達,vimentin主要在間質(zhì)細(xì)胞中表達。各組間TGF-β表達強度比較：(1)三組中TGF-β表達強度在腸結(jié)核組最高(70327.80±15523.75),其次為克羅恩病組(67823.21±6302.86),正常對照組最低(21871.33±3229.77),三組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 (2)組間比較：a.腸結(jié)核組與克羅恩病組TGF-β表達強度顯著高于正常組(PCD組va正常組=0.000,PITB組vs正常組=0.023)；b.腸結(jié)核組與克羅恩病組TGF-β表達強度比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.998)。各組間vimentin表達強度比較：(1)三組中vimentin表達強度在克羅恩病組最高(96885.84±7073.05),腸結(jié)核組次之(63583.40-10741.80),正常組最低(30959.80±3650.68),三組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)組間比較：a.腸結(jié)核組與克羅恩病組vimentin表達顯著高于正常組(PCD組vs正常組=0.000,PITB組vs正常組=0.030)；b.與腸結(jié)核組比較,克羅恩病組vimentin表達顯著增高(P=0.046)。ROC曲線分析各指標(biāo)對鑒別腸結(jié)核與克羅恩病的價值以上實驗結(jié)果表明,腸粘膜組織中總膠原纖維量、Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維量、纖維化相關(guān)蛋白vimentin表達水平在腸結(jié)核組與克羅恩病組間存在統(tǒng)計學(xué)差異。通過ROC曲線評價以上四項指標(biāo)對兩種疾病的鑒別診斷價值。曲線下面積(Area under the curve, AUC)反映診斷實驗的準(zhǔn)確性,當(dāng)曲線下面積小于0.5時無診斷價值,曲線下面積在0.5-0.7時診斷準(zhǔn)確性較低,在0.7-0.9時診斷準(zhǔn)確性較高,在0.9以上時診斷準(zhǔn)確性最高。ROC曲線分析結(jié)果顯示,腸粘膜組織中總膠原纖維量、Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維量對腸結(jié)核與克羅恩病有一定的鑒別診斷價值。以腸結(jié)核為陽性事件,總膠原纖維定量ROC曲線下面積為0.807(P=0.002,95%CI0.661-0.953),其在截斷值為16937處診斷指數(shù)最大,對鑒別兩病的靈敏度為80.0%,特異度為78.9%,陽性預(yù)測值為75.0%,陰性預(yù)測值為83.3%；Ⅰ型膠原纖維ROC曲線下面積為0.751(P=0.013,95%CI0.5890.913),其在截斷值為4392處診斷指數(shù)最大,對診斷兩病的靈敏度為86.7%,特異度為52.6%,陽性預(yù)測值為59.1%,陰性預(yù)測值為83.3%；Ⅲ型膠原纖維ROC曲線下面積為0.814(P=0.002,95% CI0.672-0.956),其在截斷值11771處診斷指數(shù)最大,對鑒別兩病的靈敏度為73.3%,特異度為73.7%,陽性預(yù)測值為68.8%,陰性預(yù)測值為77.8%。而vimentin表達強度的ROC曲線下面積為0.235(P=0.009,95% CI0.0590.411),對鑒別兩病價值不大。結(jié)論腸結(jié)核與克羅恩病在臨床特征、腸鏡及病理表現(xiàn)非常相似,臨床難以鑒別。兩病均可引起腸道不同程度纖維沉積,腸結(jié)核腸粘膜組織中總膠原纖維量、Ⅰ型膠原纖維量、Ⅲ型膠原纖維量顯著高于克羅恩病,這些指標(biāo)對鑒別兩病有一定價值,可能成為鑒別兩者的新方法。
【關(guān)鍵詞】：腸結(jié)核 克羅恩病 纖維化 轉(zhuǎn)化生長因子β 波形蛋白
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R524;R574.62
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 第一章 前言17-22
• 第二章 材料和方法22-29
• 2.1 研究對象22
• 2.2 主要試劑22-23
• 2.3 主要儀器23
• 2.4 實驗步驟和方法23-29
• 第三章 實驗結(jié)果29-45
• 3.1 腸結(jié)核組、克羅恩病組患者臨床資料比較29-34
• 3.2 總膠原纖維在各組間表達比較34-36
• 3.3 Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維在各組間表達比較36-37
• 3.4 TGF-β、vimentin在各組間表達比較37-43
• 3.5 總膠原纖維量、Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維量、vimentin鑒別腸結(jié)核與克羅恩病的ROC曲線分析43-45
• 第四章 討論45-52
• 參考文獻52-58
• 結(jié)論58-59
• 綜述59-66
• 參考文獻63-66
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文66-67
• 致謝67-68

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1 宋柳安;克羅恩病伴發(fā)肺結(jié)核1例[J];新醫(yī)學(xué);2000年05期

2 張宗友,王新,蘭梅,郭學(xué)剛,苗繼延;克羅恩病20例臨床診治體會[J];臨床內(nèi)科雜志;2001年01期

3 趙濤,鄭澤霖;克羅恩病治療現(xiàn)狀[J];醫(yī)學(xué)新知雜志;2001年02期

4 龍峻標(biāo),李愛芳,王，

本文編號：1011606