本文關(guān)鍵詞：炎癥體對肝臟天然免疫的調(diào)控及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 炎癥體 缺血再灌注 凋亡 肝細(xì)胞 血必凈 特利加壓素

【摘要】：炎癥體(inflammasome)在肝臟損傷的過程中被激活是一常見的病理生理過程,但其在肝臟損傷發(fā)生中的具體機(jī)制尚不清楚,我們通過建立兩個(gè)肝臟損傷模型—缺血再灌注(ischemia-reperfusion injury,IRI)和膽總管結(jié)扎(Bile duct ligation,BDL)模型,驗(yàn)證了NLRP3(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recuritment domain(ASC)NACHT domain,leucine-rich repeat[LRR]domain,and pyrin domain[PYD]-containing protein-3,NLRP3)炎癥體在以上兩個(gè)肝臟損傷模型中均被激活。隨后我們應(yīng)用兩種藥物從不同方面闡述了它們對天然免疫的調(diào)控作用。中國傳統(tǒng)中藥制劑血必凈注射液(Xuebijing injection,XBJ)已被廣泛用于各種感染性疾病或炎癥相關(guān)疾病的治療,但是它的抗炎作用的分子機(jī)制在很大程度上仍然是不清楚的。在目前的研究中,我們發(fā)現(xiàn),血必凈可以明顯改善小鼠肝臟缺血-再灌注損(ischemia-reperfusion,IR)傷,表現(xiàn)為改善肝功能,降低乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST),減少炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞的凋亡。值得注意的是,在小鼠肝臟的IR模型中,即使不存在Kupffer細(xì)胞的情況下,血必凈也能明顯抑制炎性體的活化和白細(xì)胞介素-1(interleukin-1β,IL-1β)的產(chǎn)生,提示Kupffer細(xì)胞在血必凈抑制肝臟IR模型炎癥體激活的過程中并不是必須的。這一發(fā)現(xiàn)促使我們研究血必凈對肝細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)的直接作用。使用體外過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)誘導(dǎo)的肝損傷模型中,我們的數(shù)據(jù)清楚地表明,血必凈有效抑制肝細(xì)胞凋亡,以時(shí)間和劑量依賴的方式抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1)和IL-1β的切割激活。這表明血必凈除了其已知的調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子Kappa-B(nuclear transcription factor Kappa-B,NF-κB)依賴性炎癥基因的表達(dá),它對肝細(xì)胞炎性體的活化也有直接影響。目前的研究不僅加深了我們對血必凈如何改善炎癥和細(xì)胞凋亡的認(rèn)識,而且許多臨床情況下,如部分肝切除,肝移植等都具有直接現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提示血必凈與血管加壓素V1受體(vasopressin V1 receptor,V1R)有相互作用,特利加壓素作為V1R的激動(dòng)劑,臨床上常用于急性靜脈曲張破裂出血的治療,但對于其保肝作用沒有具體地研究過。我們對特利加壓素治療前、后終末期肝病患者(end-stage liver diseases,ESLDs)的肝功能進(jìn)行了評估。在小鼠肝臟的IR模型中,特利加壓素降低了ALT、AST,增高了白蛋白(albumin,ALB)水平。抑制了炎癥,緩解了肝細(xì)胞凋亡,本課題探討了特利加壓素藥理作用的分子機(jī)制,提出特利加壓素可能是終末期肝臟疾病患者治療的新方法。
【關(guān)鍵詞】：炎癥體 缺血再灌注 凋亡 肝細(xì)胞 血必凈 特利加壓素
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-13
• 縮略語13-17
• 緒論17-19
• 前言19-21
• 材料與方法21-41
• 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物21
• 2、實(shí)驗(yàn)試劑21-22
• 3、實(shí)驗(yàn)耗材22
• 4、實(shí)驗(yàn)儀器22-23
• 5、實(shí)驗(yàn)方法23-41
• 5.1 小鼠肝臟IR模型的建立及干預(yù)23-24
• 5.2 BDL模型24
• 5.3 小鼠肝臟血流動(dòng)力學(xué)檢測24
• 5.4 肝臟內(nèi)kupffer細(xì)胞的去除24-25
• 5.5 小鼠原代肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)25-28
• 5.5.1 液體的配制25-26
• 5.5.2 小鼠原代肝細(xì)胞的分離26-27
• 5.5.3 小鼠原代肝細(xì)胞的計(jì)數(shù)27
• 5.5.4 小鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)27-28
• 5.6 小鼠原代肝細(xì)胞的刺激和處理28
• 5.7 體外肝細(xì)胞的缺氧-復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation ，HR) 實(shí)驗(yàn)28
• 5.8 小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)上清蛋白的濃縮28-29
• 5.9 肝臟損傷的評估29-30
• 5.9.1 ALT和AST的檢測29
• 5.9.2 TBIL的檢測29-30
• 5.10 肝細(xì)胞損傷的評估30
• 5.11 提取肝臟組織的RNA30-31
• 5.12 肝細(xì)胞RNA的提取31
• 5.13 定量的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）31-32
• 5.14 半定量RT-PCR32-33
• 5.15 肝臟組織蛋白的提取33
• 5.16 肝細(xì)胞蛋白的提取33-34
• 5.17 蛋白濃度的檢測（BCA法）34-35
• 5.18 免疫印跡（Western Blot）實(shí)驗(yàn)35-36
• 5.19 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）36
• 5.20 蘇木精—伊紅（hematoxylin and eosin,ＨＥ）染色36-37
• 5.21 免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，，IHC）37-38
• 5.22 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法（ terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTPdigoxigenin nick-end labeling，TUNEL）38
• 5.23 髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）測定38-40
• 5.24 臨床資料收集40
• 5.25 統(tǒng)計(jì)分析40-41
• 結(jié)果41-102
• 1、不同肝損傷的模型中炎癥體的激活情況41-46
• 1.1 BDL模型炎癥體激活的情況41-44
• 1.2 缺血再灌注對肝臟炎NLRP3癥體的激活44-46
• 2、NLRP3和caspase-1 基因敲除緩解了小鼠BDL引起的肝功能損傷46
• 3、血必凈通過抑制NLRP3炎癥體的激活緩解小鼠肝臟IRI46-55
• 3.1 血必凈減輕了小鼠肝臟IR后肝組織的壞死47-48
• 3.2 血必凈緩解小鼠肝臟IR后血清轉(zhuǎn)氨酶的升高48
• 3.3 血必凈減輕小鼠肝臟IRI后凋亡的發(fā)生48-50
• 3.4 血必凈抑制了小鼠肝臟IR后的炎癥基因的表達(dá)50-51
• 3.5 血必凈抑制了小鼠肝臟IR后的血清中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)51-52
• 3.6 血必凈抑制了小鼠肝臟IR后的肝臟中性粒細(xì)胞的浸潤52-53
• 3.7 血必凈抑制了小鼠肝臟IR后肝臟中MPO的活性53
• 3.8 血必凈抑制了小鼠肝臟IR后肝臟中巨噬細(xì)胞的浸潤53-54
• 3.9 血必凈抑制了小鼠肝臟IR后肝臟炎癥體的激活54-55
• 4、鑒別肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞在肝臟IR中的作用55-62
• 4.1 血必凈在Kupffer細(xì)胞清除的條件下仍能明顯減少了肝臟的壞死57-58
• 4.2 在Kupffer細(xì)胞清除的條件下血必凈仍能緩解了小鼠肝臟IR后血清轉(zhuǎn)氨酶的升高58-59
• 4.3 在清除kupffer細(xì)胞的條件下，血必凈仍能減輕小鼠肝臟IR后凋亡的發(fā)生59-60
• 4.4 在清除kupffer細(xì)胞的條件下，血必凈抑制了小鼠肝臟IR后的炎癥基因的表達(dá)60-61
• 4.5 在清除kupffer細(xì)胞的條件下，血必凈抑制了小鼠肝臟IR后肝臟炎癥體的激活61-62
• 5、肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)62-72
• 5.1 血必凈抑制了H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷62-68
• 5.1.1 血必凈濃度依賴性減少了H2O2引起的肝細(xì)胞LDH的釋放62-63
• 5.1.2 血必凈濃度依賴性減少了H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡63-64
• 5.1.3 血必凈濃度依賴性減少了H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞炎癥相關(guān)基因的表達(dá)64-65
• 5.1.4 血必凈時(shí)間依賴性減少了H2O2引起的肝細(xì)胞LDH的釋放65-66
• 5.1.5 血必凈時(shí)間依賴性減少了H2O2引起的肝細(xì)胞的凋亡66-67
• 5.1.6 血必凈在基因水平時(shí)間依賴性降低了H2O2引起的肝細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)67-68
• 5.2 血必凈抑制了H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞NLRP3炎癥體的激活68-72
• 5.2.1 血必凈濃度依賴性的抑制了H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞IL-1β 的分泌68-69
• 5.2.2 血必凈濃度依賴性的抑制了H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞NLRP3炎癥體的激活69-70
• 5.2.3 血必凈時(shí)間依賴性的抑制了H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞IL-1β 的分泌70-71
• 5.2.4 血必凈時(shí)間依賴性的抑制了H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞NLRP3炎癥體的激活71-72
• 6、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)尋找新的藥物靶點(diǎn)72-73
• 7、特利加壓素改善了終末期肝病患者的肝功能73-75
• 8、特利加壓素減輕了小鼠IR引起的肝損傷75-102
• 8.1 特利加壓素減輕了小鼠IR引起的肝壞死75-77
• 8.2 特利加壓素減輕了小鼠IR引起的炎癥反應(yīng)77-80
• 8.3 特利加壓素減輕了小鼠IR引起的凋亡80-83
• 8.4 特利加壓素的肝臟保護(hù)作用是TLR4依賴性的83-85
• 8.5 特利加壓素治療對小鼠體內(nèi)肝血流量沒有影響85-87
• 8.6 小鼠肝臟IR對加壓素及其受體的影響87-88
• 8.7 體外HR對肝細(xì)胞V1R表達(dá)的影響88-89
• 8.8 賴氨酸加壓素緩解了體外HR引起的肝細(xì)胞損傷89-92
• 8.9 賴氨酸加壓素透過抑制TLR4緩解了體外HR引起的肝細(xì)胞損傷92-93
• 8.10 賴氨酸加壓素透過V1R激活了Wnt/β-catenin/SGK/FoxO3a通路發(fā)揮其肝細(xì)胞的保護(hù)作用93-102
• 討論102-120
• 1、NLRP3炎癥體的激活102-106
• 2、kupffer在肝臟損傷中的作用106-109
• 3、肝細(xì)胞在IR的作用109-110
• 4、TLRs在IR中的作用110-111
• 5、血必凈的藥理作用111-114
• 6、Wnt信號通路在肝臟中的作用114
• 7、特利加壓素的藥理作用114-120
• 結(jié)論120-121
• 參考文獻(xiàn)121-137
• 致謝137-138
• 讀博期間學(xué)術(shù)論文和科研成果目錄138-139

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